一种以虾原肌球蛋白为致敏原的Th2反应小鼠模型的建立①

方 蕾 侯 睿 费巧玲 高 源 蔡润兰 齐 云

(中国医学科学院药用植物研究所，北京100193)

·免疫学技术与方法·

一种以虾原肌球蛋白为致敏原的Th2反应小鼠模型的建立①

方 蕾 侯 睿 费巧玲 高 源 蔡润兰 齐 云

(中国医学科学院药用植物研究所，北京100193)

目的：采用虾原肌球蛋白为致敏原建立Th2反应小鼠模型。方法：虾原肌球蛋白腹腔注射小鼠6周诱导Th2反应，ELISA测定小鼠血清总IgE、sIgE和sIgG水平、脾淋巴细胞分泌Th1和Th2细胞因子的含量，采用流式细胞术检测血液中嗜碱性粒细胞的活化。结果：与对照组比较，致敏6周的小鼠血清总IgE、sIgE和sIgG(sIgG1、sIgG2a和sIgG2b)均显著升高；脾淋巴细胞在抗原刺激后分泌Th2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-10和IL-13)增加，而Th1细胞因子INF-γ则出现明显降低；血液中嗜碱性粒细胞表面标志物CD200R和CD41表达增强。结论：成功建立一种以虾原肌球蛋白为致敏原的Th2反应小鼠模型。

Th2反应；虾原肌球蛋白；嗜碱性粒细胞；IgE

辅助T细胞(T helper，Th)是由初始CD4+T细胞分化而来。初始CD4+T细胞在胸腺内成熟后迁移至外周淋巴器官，与激活的抗原呈递细胞相互作用分化为Th1、Th2、Th17和调节性T细胞等多种功能亚群，Th细胞通过细胞因子网络维持动态平衡。目前认识到Th1/Th2细胞失衡现象存在于感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病和变态反应性疾病等多种疾病中[1]，而Th2优势反应最常见于过敏性疾病，与IgE生成密切相关。在实验研究中，Ⅰ 型过敏反应动物模型通常以卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)和二硝基苯酚(Dinitrophenol，DNP)与载体蛋白的偶联物诱导。前者模拟大分子致敏，后者则模拟小分子(半抗原)致敏。但我们的研究结果却显示OVA对啮齿类动物IgE的诱导情况并不理想，尤其在没有佐剂的情况下更为明显[2]。这与普通鼠饲料含蛋粉，长期食用致免疫耐受有关[3]。而小分子DNP诱导的过敏模型代表半抗原致敏，并不能完全替代临床上对大分子(蛋白质、多肽)致敏的情形。因此，实验研究中迫切需要一种致敏性高的大分子抗原物质。虾蛋白也是食品中极重要的一类变应原[4]，且不是普通鼠饲料中的必须组分。通过与相同剂量条件下的OVA进行比较，小鼠对虾蛋白的响应性远高于OVA[2]。据此，我们提取了虾的主要过敏原成分——原肌球蛋白，诱导小鼠模型，从与IgE生成密切相关的Th2效应来探讨虾原肌球蛋白致敏模型的特点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和细胞 雌性BALB/c小鼠(6～8周龄)，16～18 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证编号：SCXK(京)2012-0001]。于中国医学科学院药用植物研究所SPF级动物房常规饲养。

1.1.2 主要试剂 小鼠IgE ELISA试剂盒购自美国Biolegend公司，protein G PLUS-Agarose购自美国Santa cruz biotechnology公司，HRP标记的大鼠抗小鼠IgE二抗购自英国Abcam公司，兔抗小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b抗体购自美国OriGene Technologies公司，FITC标记的抗小鼠IgE、PerCP-eFluor 710标记的抗小鼠CD41、PE标记的抗小鼠CD200R抗体购自美国BD Bioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 铝佐剂的配制 分别配制质量分数5%的Al2(SO4)3溶液和NaOH溶液，取Al2(SO4)31.0 g，溶于20 ml无菌三蒸水中，即NaOH 0.4 g，溶于8 ml无菌三蒸水中；在强烈搅拌下，将NaOH加入Al2(SO4)3中，4 000 r/min离心15 min，无菌生理盐水重悬2次，最终以生理盐水定容至20 ml，-20℃分装保存。

1.2.2 虾原肌球蛋白的提取和鉴定 取新鲜的刀额新对虾(Metapenaeusensis)，去头去壳，虾肉研碎匀浆，参照文献[5]采用等电点沉淀的方法提取原肌球蛋白，通过SDS-PAGE对其分子量进行鉴定。

1.2.3 虾原肌球蛋白诱导小鼠Th2反应 小鼠随机分为佐剂对照组和模型组。虾原肌球蛋白配制成400 μg/ml(生理盐水配制)，再加入等体积的铝佐剂，虾原肌球蛋白的终浓度为200 μg/ml。模型组小鼠腹腔注射0.1 ml虾原肌球蛋白，即20 μg/只，每周1次，共6周。佐剂对照组则给予等体积含佐剂的生理盐水。

1.2.4 ELISA法测定小鼠血清总IgE及抗原特异性IgE(antigen-special immunoglobulin E，sIgE) 小鼠6周末摘眼球取血，分离血清，参照ELISA测定试剂盒说明书测定总IgE的含量。sIgE的检测参考文献[6]所述，并加以改进：待测血清先与protein G PLUS-Agarose以体积比1∶9混合，除去血清中的IgG。室温反应30 min，期间每隔5 min混悬1次；2 500 r/min 离心10 min，取上清；将上清以PBS稀释10倍后取100 μl加入预包被虾原肌球蛋白的ELISA板(1 μg/孔)中，37℃孵育1 h；PBST洗板4次，加入HRP-大鼠抗小鼠IgE二抗(1∶5 000稀释)，100 μl/孔，37℃孵育1 h；PBST洗板5次，TMB显色37℃孵育10 min，每孔加100 μl 2 mol/L H2SO4终止，于450 nm处读数。

1.2.5 ELISA法测定小鼠抗原特异性IgG(antigen-special immunoglobulin G，sIgG) 取6周末小鼠血清检测sIgG，方法与上述测定sIgE的方法相似：待测血清稀释后直接加入包被虾原肌球蛋白的ELISA板中，37℃孵育1 h；PBST洗板4次，加入兔抗小鼠IgG1(1 ng/ml)或IgG2a(2 μg/ml)或IgG2b抗体(1 ng/ml)，37℃孵育1 h；PBST洗板4次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；PBST洗板4次，37℃ TMB孵育10 min显色，H2SO4终止，于450 nm处读数。

1.2.6 流式细胞术检测血液中嗜碱性粒细胞CD200R和CD41的表达 小鼠摘眼球取血，全血置于EDTA-K2抗凝管中，取抗凝血100 μl加入终浓度为5 μg/ml的虾原肌球蛋白，37℃孵育。2 h后，加入FITC标记的抗小鼠IgE、PerCP-eFluor 710标记的抗小鼠CD41和PE标记的抗小鼠CD200R抗体，4℃避光孵育15 min，再加入流式专用红细胞裂解液2 ml避光孵育5 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加2 ml PBS洗1次，离心，最后加0.3 ml PBS重悬细胞，FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司)检测，收集1 000个IgE+细胞，于流式分析软件Flowjo 7.6.1中分析CD200R和CD41的表达(Mean fluorescence intensity，MFI)。

1.2.7 虾原肌球蛋白刺激小鼠脾淋巴细胞72 h分泌细胞因子 小鼠于6周末处死后，于75%酒精中浸泡5 min消毒皮毛。参照文献[5]，无菌条件下取脾脏，制备脾细胞悬液，以4×106个/孔铺24孔板，各孔加入终浓度为4 μg/ml虾原肌球蛋白，37℃孵育培养。蛋白刺激72 h后，取上清采用ELISA法测定IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和IFN-γ的含量。

2 结果

2.1 模型小鼠血清总IgE和sIgE 经电泳鉴定提取的刀额新对虾原肌球蛋白分子量为36 kD，与文献报道吻合[7]。采用虾原肌球蛋白诱导小鼠模型，与对照组比较，第6周的动物血清总IgE和sIgE含量均明显升高(P<0.01)，见图1。

2.2 模型小鼠血清sIgG1、sIgG2a和sIgG2b 由图2可见，与对照组比较，模型组小鼠血清sIgG2a、 sIgG2b和sIgG1均明显升高(P< 0.01)。从血清稀释倍数可见，以sIgG1含量最高。

图1 小鼠血清总IgE和sIgE含量Fig.1 Levels of total IgE and sIgE in serum of ST-sensitized miceNote: Mice were sensitized by ST intraperitoneally once a week.At day 42,sera from different groups of mice were obtained.The total IgE (A) and sIgE (B) levels were determined by using ELISA.Data present the ±s(n=6).##.P< 0.01 vs control group.

图2 模型小鼠血清sIgG1、sIgG2a和sIgG2b含量Fig.2 Levels of sIgG1,sIgG2a and sIgG2b in serum of ST-sensitized miceNote: Mice were sensitized by ST intraperitoneally once a week.At day 42,sera from different groups of mice were obtained.The levels of sIgG1 (A),sIgG2a (B) and sIgG2b (C) were determined by using ELISA.Sera were diluted 1∶2×105 for sIgG1,1∶1 000 for sIgG2a,and 1∶4×104 for sIgG2b.Data present the ±s(n=6).##.P< 0.01 vs control group.

图3 虾原肌球蛋白刺激模型小鼠脾细胞分泌细胞因子Fig.3 Splenocyte cytokine secretion in response to STNote: Spleen cells from control or ST-sensitized mice were cultured for 72 h in the presence of ST.Cytokines in culture supernatants (A.IL-4,B.IL-5,C.IL-10,D.IL-13 and E.IFN-γ) were measured by ELISA.Data present the ±s(n=5).##.P< 0.01 vs control group.

图4 模型小鼠血液中嗜碱性粒细胞CD200R和CD41的表达Fig.4 Basophil CD200R and CD41 expression in response to STNote: Whole blood was incubated with ST.MFI of CD200R (A,C-F) and CD41 (B,G-J) on basophils were analyzed by flow cytometry.).#.P< 0.05,##.P< 0.01 vs control group.

2.3 虾原肌球蛋白刺激模型小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子 通过预实验我们考察了虾原肌球蛋白(0.5～8 μg/ml剂量范围)的最佳刺激量为4 μg/ml。在该造模剂量条件下，如图3所示，与对照组比较，抗原刺激模型小鼠脾淋巴细胞72 h可见上清中IL-4、IL-5、IL-10和IL-13含量均显著升高(P<0.01)，而模型组的IFN-γ则显著降低(P<0.01)。

2.4 模型小鼠血液中嗜碱性粒细胞CD200R和CD41的表达 通过预实验我们考察了5～20 μg/ml剂量范围内虾原肌球蛋白的体外刺激小鼠抗凝血合理剂量为5 μg/ml。抗原与抗凝血孵育2 h后，模型组CD200R的表达较对照组明显增强(图4E、F：CD200R+嗜碱性粒细胞对照组2.17% vs 模型组52.9%)；CD41的表达也增加，但是不如CD200R趋势显著(图4I、J：CD41+嗜碱性粒细胞对照组18.3% vs 模型组33.0%)。

3 讨论

Ⅰ型过敏反应常见Th2优势反应，Th2细胞因子是促进B细胞发生抗体类型转换生成IgG1和IgE类抗体的关键因子。过敏患者可见血清sIgG、sIgG1和sIgE的明显升高[8]；Th2细胞因子IL-4在哮喘患儿血清中浓度升高，而Th1细胞因子IFN-γ浓度则下降，出现Th1/Th2细胞免疫失衡[9]。在本文建立的以虾原肌球蛋白为抗原的小鼠Th2模型中，小鼠血清总IgE、sIgE和sIgG(sIgG以sIgG1含量最高)含量均显著增加(图1～2)；同时，抗原刺激模型小鼠脾细胞分泌的Th2细胞因子IL-4、IL-5、IL-10和IL-13均显著升高，而Th1效应则受到抑制，IFN-γ的含量明显下降(图3)，可见该模型呈现典型的Th2反应亢进。

人们很早就认识到肥大细胞是 Ⅰ 型过敏反应的主要参与者，通过IgE介导其激活。然而，和肥大细胞表型和功能相似的嗜碱性粒细胞，由于占白细胞总数的比例不到1%，在很长一段时期内，都被认为是血液循环中残余的肥大细胞，对其功能关注并不多。近年来，国内外学者发现多种过敏性疾病的发生以及发病的严重程度与人体内能够激活的致敏嗜碱性粒细胞(其表面标志物CD63的表达增强)的比例以及脱颗粒的程度相关[10，11]。随着嗜碱性粒细胞条件性缺失技术的发展和高纯度细胞分选技术的应用，嗜碱性粒细胞的新生物学作用被逐一阐明：目前已发现它不仅是Th2细胞因子IL-4的主要来源细胞，而且可能具有潜在独立的或协同树突状细胞的抗原提呈作用，调节Th2应答[12]。进一步的研究则明确了嗜碱性粒细胞参与过敏性哮喘小鼠Th2反应：抗原致敏和激发导致了小鼠血液和肺组织中嗜碱性粒细胞的数量明显增加，同时伴随其激活标志物CD200R的表达上调。然而，采用MAR-1或Ba103抗体清除嗜碱性粒细胞后气道炎症明显减轻，脾脏和引流淋巴结Th2亚群减少，肺组织IL-4和血清sIgE均显著降低[13]。目前，小鼠嗜碱性粒细胞激活标志物研究并不多，研究显示小鼠的嗜碱性粒细胞CD200R的激活和胞内IL-4的水平成正相关[14]；CD41是血小板和巨核细胞的标志物，还表达于人和小鼠骨髓来源的肥大细胞，2014年有研究者首次尝试将CD41作为寄生虫感染性疾病嗜碱性粒细胞活化的标志物[15]。在本文建立的以虾原肌球蛋白为抗原的Th2模型中，我们检测到小鼠血液中嗜碱性粒细胞表面活化标志物CD200R和CD41表达明显增强(图4)，表明嗜碱性粒细胞处于激活状态。

综上所述，虾原肌球蛋白克服了传统大分子抗原OVA在啮齿类动物中的免疫耐受问题，具有更高的致敏性，可能是经典致敏原的一个更好的替代品。经腹腔注射虾原肌球蛋白能够成功诱导小鼠发生明显的Th2优势反应，产生与临床Ⅰ型过敏反应患者类似的免疫学改变，表现为脾淋巴细胞分泌Th2细胞因子IL-4、IL-5、IL-10和IL-13增加，分泌Th1细胞因子IFN-γ的含量明显下降，呈现Th1/Th2免疫反应的明显失衡；血清抗体水平总IgE、sIgE和sIgG的含量升高；血液中嗜碱性粒细胞活化，其表面活化标志物CD200R和CD41表达明显增强。该模型的应用价值在于，研究者们能够利用这种以Th2反应为主的动物模型为基础选择进行多种实验，例如可直接以抗原激发建立全身(经静脉)或局部(经呼吸道)的主动过敏模型，或采用其富含IgE的致敏血清可用于被动皮肤过敏反应模型；而脾细胞反应以及嗜碱性粒细胞激活实验均可用于体外抑制Th2反应药物的评价，这些将为抗过敏性疾病创新药物的机制研究提供良好的应用平台。

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[收稿2016-06-16 修回2016-08-25]

(编辑 倪 鹏)

A murine model of Th2 response induced by shrimp tropomyosin

FANGLei,HOURui,FEIQiao-Ling,GAOYuan,CAIRun-Lan,QIYun.

InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100193，China

Objective:To develop murine models of Th2 response induced by shrimp tropomyosin (ST).Methods: Mice were sensitized with ST for 6 weeks.The serum antigen-special IgE (sIgE),total IgE and sIgG level,Th1/Th2 cytokines production were measured by ELISA.The basophil activation in mice was measured by flow cytometry.Results: The intraperitoneal sensitization with ST for 6 weeks induced significant increase of serum sIgE,total IgE and sIgG (sIgG1,sIgG2a and sIgG2b) level in mice.Th2 cell response was induced and cytokines (IL-4,IL-5,IL-10 and IL-13) production increased in splenocytes stimulated by ST,while Th1 cytokine (IFN-γ) production decreased.As the markers of basophil activation,CD200R and CD41 expression also increased in response to ST.Conclusion: The Th2 response is dominant in ST-induced anaphylaxis in mice.

Th2 response;Shrimp tropomyosin;Basophil;IgE

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.014

①本文受国家科技重大专项(2014ZX09201022-006)和北京市自然科学基金项目(7142112)资助。

方 蕾(1983年-)，女，博士，讲师，主要从事抗过敏中药药理学研究，E-mail：fanglei@yzu.edu.cn，就职于扬州大学医学院。

及指导教师：齐 云(1964年-)，男，博士，研究员，博士生导师，主要从事抗炎免疫药理学研究，E-mail：yqi@implad.ac.cn。

R392.8

A

1000-484X(2017)02-0233-05