阿托伐他汀对人 NK细胞杀伤结肠癌细胞的影响及其机制研究①

姬会春 刘军权 周 燏 李 昳 陈复兴 费素娟

(宿迁市第一人民医院，宿迁223800)

阿托伐他汀对人 NK细胞杀伤结肠癌细胞的影响及其机制研究①

姬会春 刘军权②周 燏②李 昳②陈复兴②费素娟③

(宿迁市第一人民医院，宿迁223800)

目的：探讨阿托伐他汀对人NK细胞杀伤结肠癌细胞的影响及其机制。方法：不同浓度的阿托伐他汀作用于3株结肠癌细胞(HCT-116、SW-480、Caco-2)，CCK-8法测定阿托伐他汀对结肠癌细胞生长抑制率的影响。SCGM培养基体外扩增人NK细胞，自动生化分析仪测定NK细胞对3株结肠癌细胞的杀伤活性；流式细胞仪检测结肠癌细胞MICA/B的表达率。结果：(1)NK细胞的培养：培养前CD3-CD56+的NK细胞占外周血单个核细胞的比例为4.5%，培养10 d时NK细胞的比例增至93.1%。(2)阿托伐他汀对3株结肠癌细胞生长抑制率的影响：阿托伐他汀作用48 h后，在浓度5～40 μmol/L的4个实验组中，HCT-116细胞的生长抑制率较对照组升高(P<0.05)。作用96 h后，在1.25～40 μmol/L的所有浓度组(6个)中，HCT-116细胞的生长抑制率均显著高于对照组(P<0.05)。另外， HCT-116细胞的生长抑制率随着阿托伐他汀浓度的升高而逐渐上升，相关分析显示，阿托伐他汀的浓度与HCT-116细胞的生长抑制率呈正相关(r[48 h]=0.13，r[96 h]=0.22，P<0.05)。(3)NK细胞经阿托伐他汀作用96 h后，除浓度为20 μmol/L和40 μmol/L时抑制率高于对照组，其他各组对NK细胞生长无明显影响。(4)阿托伐他汀对NK细胞杀伤结肠癌细胞活性的影响：NK细胞对HCT-116细胞的杀伤活性在阿托伐他汀浓度2.5～10 μmol/L组均显著高于对照组，对SW-480的杀伤活性在5～20 μmol/L组较对照组明显升高，对Caco-2的杀伤活性在2.5～20 μmol/L组显著高于对照组(P<0.05)，其中同一浓度时对HCT-116细胞杀伤作用最强。(5)阿托伐他汀对结肠癌细胞MICA/B表达的影响：在阿托伐他汀浓度2.5 μmol/L及5 μmol/L组，HCT-116细胞MICA/B的表达率与对照组比较显著升高(P<0.05)，在10 μmol/L及20 μmol/L组，SW-480细胞MICA/B表达率显著高于对照组(P<0.05)，在2.5～40 μmol/L 组，Caco-2细胞MICA/B的表达率均较对照组显著升高(P<0.05)。 结论：(1)阿托伐他汀能够呈剂量依赖性抑制结肠癌细胞HCT-116、SW-480 及Caco-2的生长；(2)阿托伐他汀能够增强NK细胞对结肠癌细胞的杀伤活性，可能与阿托伐他汀上调结肠癌细胞MICA/B的表达有关；(3)阿托伐他汀可以上调3株结肠癌细胞MICA/B的表达率，提高结肠癌细胞的免疫原性。

阿托伐他汀；结肠癌细胞；NK细胞；MICA/B

结肠癌是一种发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤，居我国恶性肿瘤发病率第五位，男性发病率的第五位，女性的第三位[1]。全球每年约有50万患者死于结肠癌[2]。临床上确诊时大都已经发展为中晚期，错过了最佳手术期，其预后差、病死率高。结肠癌的非手术治疗越来越受到业内人士的关注。 他汀类药物是临床常用的降血脂药物。近年来有研究表明，他汀类药物具有抗肿瘤作用[3]，阿托伐他汀为人工合成的他汀类降血脂药物。自然杀伤(Natural killer，NK)细胞是人体第一道免疫防线的重要组成部分，有强大的抗肿瘤、抗感染及清除非己细胞等作用[4]。临床上NK细胞过继免疫治疗多种肿瘤已取得了一些疗效。但其临床抗肿瘤的疗效一直未能得到大幅度的提高，如何增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性是提高NK细胞抗肿瘤疗效的关键。目前尚没有阿托伐他汀与NK细胞联合应用进行抗肿瘤研究的报道。本文拟探讨阿托伐他汀对NK细胞杀伤结肠癌细胞的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 阿托伐他汀(辉瑞制药有限公司)；人结肠癌细胞株HCT-116(低分化腺癌)、SW-480(低分化腺癌)和Caco-2(人克隆结肠腺癌细胞)(中科院上海细胞所)；无血清培养基和NK细胞培养基(浙江博纳生物科技有限公司产品)；PE标记MICA/B(美国BD公司)；淋巴细胞分离液(中国科学院血液病研究所)；PE标记的CD3、FITC标记的CD56(美国BD公司)；ST-360酶标仪(上海科华实验系统有限公司)；Encore自动生化分析仪(北京希亚克技术有限公司)；荧光倒置显微镜TE2000-S(日本Nikon公司)；流式细胞仪(Flow cytometry，FCM)(美国BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 NK细胞的培养和鉴定 使用淋巴细胞分离液常规分离健康个体外周血获得单个核细胞，PBS洗涤2次，将细胞加入含有rhIL-2 和人AB血浆的NK培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，收集培养10 d的NK细胞，PBS洗涤2次，调整细胞浓度为1×107ml-1。取100 μl细胞悬液，分别加入 FITC-Anti-CD56和PE-Anti-CD3，室温避光孵育15 min，PBS洗涤并重悬细胞，FCM进行表型检测。

1.2.2 CCK-8测阿托伐他汀对结肠癌细胞生长的影响 为了筛选出阿托伐他汀对结肠癌细胞(HCT-116、SW-480和Caco-2细胞)抑制最佳药物浓度和作用时间。收集对数生长期的HCT-116细胞，PBS洗涤3次，使用含10%小牛血清的McCoy′S5A培养基将细胞配成1×104ml-1的细胞悬液；SW-480和Caco-2细胞按同样的方法收集，并置于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，配成1×104ml-1的细胞悬液。3株细胞分别加入96孔板内，培养24 h后加入不同浓度的阿托伐他汀(终浓度分别为1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L)，同时设DMSO溶剂对照组，每组设3个复孔。置于37℃、5%CO2培养箱内培养。分别于24、48、72和92 h每孔加入CCK-8 20 μl，继续培养4 h，轻轻摇匀，于酶标仪450 nm波长处测OD值。按下列公式计算结肠癌细胞的生长抑制率。生长抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.3 阿托伐他汀诱导NK细胞的方法 收集培养10 d的NK细胞，PBS洗涤3次，用NK细胞培养基将细胞配成1×105ml-1的细胞悬液，加入96孔板，200 μl/孔。然后加入终浓度分别为0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L的阿托伐他汀，同时设DMSO溶剂对照组，每组设5个复孔。置于37℃、5%CO2培养箱内培养。分别于24、48、72和92 h每孔加入CCK-8 20 μl，继续培养4 h，轻轻摇匀，于酶标仪450 nm波长处测OD值。按下列公式计算NK细胞生长抑制率：生长抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.4 LDH释放法检测NK细胞对结肠癌细胞杀伤活性 将复苏后的结肠癌细胞HCT-116、SW-480和Caco-2体外传代培养，对数生长期时分别给予胰酶消化，收集3株结肠癌细胞，洗涤3次，使用相应的培养基将细胞配成5×105ml-1的细胞悬液，加入6孔细胞培养板。分别将不同浓度的阿托伐他汀(终浓度0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)加入细胞培养板中，置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。收集培养第48小时结肠癌细胞，将细胞密度调整为2×105ml-1，作为靶细胞。以培养10 d后的NK 细胞为效应细胞，调整细胞密度为2×106ml-1，按效靶比10∶1接种于试管中。同时设效应细胞自然释放组、靶细胞自然释放组、靶细胞最大释放组，置 37℃、5%CO2细胞培养箱培养6 h，1 000 r/min离心5 min，吸取上清液，自动生化分析仪测LDH值。按下列公式计算NK细胞的杀伤活性。NK细胞的杀伤活性 =(实验组LDH值-效应细胞自然释放组LDH值)/(靶细胞最大释放组LDH值-靶细胞自然释放组LDH值)×100%。

1.2.5 结肠癌细胞MICA/B表达的检测 分别收集3株结肠癌细胞，调整细胞密度为5×105ml-1，以每孔5 ml接种于6孔板内，加入不同浓度的阿托伐他汀(终浓度0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)，置于37℃、5%CO2培养箱内培养48 h，收集细胞，PBS洗涤，细胞密度调至1×107ml-1，取细胞悬液100 μl，加入PE-MICA/B 20 μl，室温避光孵育15 min，同时设同型IgG1对照。PBS洗涤并重悬细胞，FCM检测MICA/B的表达。

2 结果

2.1 NK细胞的鉴定 流式细胞术检测结果显示，培养前血CD3-CD56+的NK细胞占外周血单个核细胞的比例为4.5%。培养10 d时NK细胞的比例增至93.1%，符合实验要求，见图1。

2.2 不同浓度的阿托伐他汀对3株结肠癌细胞生长的影响

2.2.1 阿托伐他汀对HCT-116细胞生长的影响 由表1、图2可见，不同浓度的阿托伐他汀作用24、48、72和96 h时，结肠癌细胞HCT-116(低分化腺癌)的生长抑制率均较对照组升高，统计分析显示，作用48 h后，阿托伐他汀浓度5～40 μmol/L的4个实验组中，HCT-116细胞的生长抑制率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。作用96 h后，阿托伐他汀1.25～40 μmol/L的所有浓度组(6个)中，HCT-116细胞的生长抑制率均显著高于对照组(P<0.05)。另外， HCT-116细胞的生长抑制率随着阿托伐他汀浓度的升高而逐渐上升，相关分析显示，阿托伐他汀的浓度与HCT-116细胞的生长抑制率呈正相关(r[48 h]=0.13，r[96 h]=0.22，P<0.05)。阿托伐他汀浓度相同时，HCT-116细胞的生长抑制率在24 h和48 h组与72 h和96 h组之间比较，除1.25、2.5和5 μmol/L组外，差异均有统计学意义(P<0.05)。以上结果提示，阿托伐他汀能够呈剂量依赖性抑制HCT-116细胞的生长，且延长作用时间可以增强阿托伐他汀对HCT-116细胞生长的抑制作用。其他结果见表1。

2.2.2 阿托伐他汀对SW-480细胞生长的影响 阿托伐他汀作用24 h和48 h后，浓度1.25～40 μmol/LNote：1)P<0.05 compared with the control group;2)P<0.05 compared with the 24 and 48 h group.的6个浓度组中，结肠癌细胞SW-480(低分化腺癌)的生长抑制率均显著高于对照组，统计分析差异均具有统计学意义(P<0.05)；作用72 h和96 h后，阿托伐他汀浓度2.5～40 μmol/L的5个浓度组中，SW-480细胞的生长抑制率均较对照组显著升高(P<0.05)。另外，随着阿托伐他汀浓度的增高，SW-480细胞的生长抑制率逐渐升高，相关分析结果显示，SW-480的生长抑制率与阿托伐他汀浓度呈正相关(r[48 h]=0.16，r[96 h]=0.19，P<0.05)，阿托伐他汀浓度相同时，较高浓度组(10～40 μmol/L)中，SW-480细胞的生长抑制率在96 h组显著高于24 h和48 h 组(P<0.05)。上述结果提示阿托伐他汀能够呈剂量依赖性抑制结肠癌细胞SW-480的生长，且较高浓度时延长作用时间能够提高阿托伐他汀对SW-480细胞的生长抑制作用，见表2、图3。

图1 NK细胞的鉴定(FCM检测)Fig.1 FCM results of NK cells cultured before and after 10 days

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)InhibitionrateofHCT⁃116cells(%)24h48h72h96h0(Controlgroup)0000125120±008208±018635±0441)2)836±0181)2)25130±009160±015745±0541)2)961±0201)2)5279±011379±0381)812±0591)2)851±0281)2)10312±012352±0341)999±0761)2)1158±0441)2)20595±0341)726±0141)1473±1211)2)1912±1251)2)401256±1221)2168±1401)4126±3121)2)4546±1961)2)

2.2.3 阿托伐他汀对Caco-2细胞生长的影响 阿托伐他汀作用24、48、72和96 h时后，浓度1.25～40 μmol/L的6组中，结肠癌细胞Caco-2(人克隆腺癌细胞)的生长抑制率均显著高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。而且，Caco-2细胞的生长抑制率随阿托伐他汀浓度增加而逐渐升高，相关分析显示，两者呈正相关(r[48 h]=0.20，r[96 h]=0.23，P<0.05)。阿托伐他汀浓度相同时，除40 μmol/L 组外，Caco-2细胞的生长抑制率在48 h组与72 h和96 h组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。上述结果证实，阿托伐他汀能够有效抑制结肠癌细胞Caco-2的生长，且呈剂量依赖性，但延长作用时间并不能提高阿伐他汀对Caco-2细胞生长的抑制作用。其他结果见表3、图4。

图2 阿托伐他汀对HCT-116细胞生长的影响Fig.2 Effect of different concentrations of atorvastatin on HCT-116 cells growthNote: *.P<0.05 compared with the control group.

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)Inhibitionrateofcells(%)24h48h72h96h0(Controlgroup)0000125423±0351030±0781)823±0531)311±03225733±0561)1525±1221)1026±0981)583±0401)51218±1141)2431±1941)1836±1321)2491±2101)101631±1121)2212±1961)2598±1971)3631±3921)2)202247±1191)2651±2111)3265±2361)2)3941±1671)2)402636±1291)3173±2231)4023±3381)2)4523±3771)2)

Note：1)P<0.05 compared with the control group;2)P<0.05 compared with the 24 and 48 h group.

2.3 不同浓度的阿托伐他汀对NK细胞生长的影响 NK细胞经不同浓度的阿托伐他汀作用24～96 h后，除诱导96 h浓度为20 μmol/L和40 μmol/L 两组对NK细胞抑制率高于对照组外(差异有统计学意义，P<0.05)，其他各组阿托伐他汀对NK细胞生长均无明显影响，组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4、图5。

图3 阿托伐他汀对SW-480细胞生长的影响Fig.3 Effect of different concentrations of atorvastatin on SW-480 cells growthNote: *.P<0.05 compared with the control group.

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)Inhibitionrateofcells(%)24h48h72h96h0(Controlgroup)0000125325±024405±015423±031436±02525957±0431)1331±1051)915±0641)772±0371)51639±1291)2495±1991)2036±1981)2163±1911)102037±1911)2372±2271)2145±1731)2398±2391)202378±1871)2928±2641)2948±2571)3359±2851)402967±2061)3307±2891)3649±3121)4418±3541)2)

Note：1)P<0.05 compared with the control group;2)P<0.05 compared with the 24 and 48 h group.

2.4 阿托伐他汀对NK细胞杀伤结肠癌细胞活性的影响 从表5、图6可见，NK细胞对HCT-116细胞的杀伤活性在阿托伐他汀2.5～10 μmol/L的3个浓度组中均显著高于对照组(P<0.05)，对SW-480的杀伤活性在5～20 μmol/L的3个浓度组较对照组显著升高(P<0.05)，而对Caco-2的杀伤活性在2.5～20 μmol/L的4个浓度组中均显著升高(P<0.05)。另外，在阿托伐他汀2.5 μmol/L及5 μmol/L 的2个浓度组中，NK细胞对HCT-116细胞的杀伤活性均显著高于对SW-480及Caco-2的杀伤活性(P<0.05)，其中，浓度5 μmol/L时NK细胞对HCT-116细胞的杀伤活性最高，浓度为10 μmol/L时NK细胞对SW-480、 Caco-2杀伤活性最强。以上结果提示阿托伐他汀能够提高NK细胞对3株结肠癌细胞的杀伤活性，但对3株结肠癌细胞的作用存在差异，其中对HCT-116细胞的作用最强。

2.5 阿托伐他汀对3株结肠癌细胞MICA/B表达的影响 不同浓度的阿托伐他汀对3株结肠癌细胞MICA/B表达的影响存在差异，在阿托伐他汀浓度2.5 μmol/L及5 μmol/L组，HCT-116细胞MICA/B的表达率与对照组比较显著升高(P<0.05)，其中2.5 μmol/L组HCT-116细胞MICA/B表达率最高。

图4 阿托伐他汀对Caco-2细胞生长的影响Fig.4 Effect of different concentrations of atorvastatin on Caco-2 cells growthNote: *.P<0.05 compared with the control group.

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)Reproductionrateofcells(%)24h48h72h96h0(Controlgroup)0000125008±001015±002018±002051±00825031±003045±005098±007073±0075054±006067±007064±005004±00510001±001007±001-091±009-101±04220-047±007-089±009-106±018-267±0381)40-054±011-119±027-214±0411)-278±0361)

Note：1)P<0.05 compared with the control group.

图5 经阿托他汀诱导96 h后的NK细胞生长情况Fig.5 Effect of after 96 h induced by atorvastatin on NK cells growthNote: *.P<0.05 compared with the control group.

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)KillingactivityofNKcellsHCT⁃116SW⁃480Caco⁃20(Controlgroup)4023±2343071±2743282±230255932±3901)2)3452±4424023±2771)56230±2461)2)3846±1901)4673±3321)105042±5641)4461±2351)4983±2501)204532±2393672±1271)4214±3981)403943±5463344±3253545±162

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the SW-480,Caco-2,2)P<0.05.

图6 阿托伐他汀对NK细胞杀伤结肠癌细胞活性的影响Fig.6 Killing activity of NK cells to colon cancer cell which cultured with atorvastatinNote: *.P<0.05 compared with the control group;△.P<0.05 compared with the SW-480,Caco-2.

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)ColoncancercellsMICA/Bexpressionrate(%)HCT⁃116SW⁃480Caco⁃20(Controlgroup)5129±280342±0582042±209257098±2101)400±0502891±1691)56487±3271)396±0293502±4131)105540±3831722±2441)4855±4421)204242±4471430±2411)4900±3231)402719±2781)430±0764036±2261)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05.

图7 不同浓度的阿托伐他汀对结肠癌细胞MICA/B表达的影响Fig.7 Effect of different concentrations of atorvastatin on colon cancer cells MICA/B expression rateNote: *.P<0.05 compared with the control group.

SW-480细胞MICA/B表达率在阿托伐他汀10 μmol/L及20 μmol/L组显著高于对照组(P<0.05)。在阿托伐他汀2.5～40 μmol/L的5个浓度组中，Caco-2细胞MICA/B的表达率均较对照组显著升高(P<0.05)。其中，阿托伐他汀浓度10 μmol/L组 SW-480细胞的MICA/B表达率最高，20 μmol/L组Caco-2细胞的MICA/B表达率最高(见表6、图7)。本组实验结果证实，适宜浓度的阿托伐他汀可以上调3株结肠癌细胞MICA/B的表达率，提高结肠癌细胞的免疫原性。

3 讨论

近年来，随着我国经济的发展、人们生活习惯、饮食结构的改变及环境污染等，结肠癌的发病率呈逐年上升趋势，新发病例以每年4%的速度增长，每年新发病例超过17万，现已成为我国发病率上升最快的恶性肿瘤之一[5,6]， 且发病年龄越来越年轻化，病程较为漫长，反复发作，给患者带来了极大的痛苦，严重威胁国人的健康。 根据目前结肠癌的发病形势，传统的手术治疗仍然是治疗结肠癌的主要手段，但因发现时机较晚，许多患者已经失去手术治疗的意义。而放化疗副作用大，患者耐受力差，也限制了该治疗方式的广泛应用。积极寻找新的有效低毒的治疗结肠癌的药物具有重要的临床意义。目前结肠癌的发病原因尚不明确，最近有报道表明肿瘤的发生发展与机体的免疫状态密切相关，可能为自身免疫性疾病，细胞免疫与实体肿瘤的抗肿瘤机制有关[7]。现在有越来越多临床工作者正在研究利用药物增强免疫细胞的抗肿瘤功能来达到肿瘤治疗的目的。

他汀类药物作为临床常用的降血脂药物已被广泛用于治疗心血管疾病，随着对该类药物研究的深入，人们发现他汀类药物还具有抗肿瘤作用，且已经受到越来越多的学者关注。 他汀类药物可通过抑制HMG-CoA还原酶阻断胆固醇的合成，甲羟戊酸(Mevalonate，MVA)是胆固醇合成的中间产物，可参与细胞生长和分化过程中所必需的GTP酶的戊烯化。多项研究表明他汀类药物的抗肿瘤可能与以下机制有关：(1)他汀类药物可通过阻断MVA合成途径影响细胞周期，使肿瘤细胞停滞于G0-G1期或G1-S期，从而抑制肿瘤细胞的增殖[8,9]。(2)他汀类药物还可通过抑制基因转录后的异戊二烯化而抑制细胞生长，且MVA能够逆转上述作用，推测异戊二烯代谢物具有调节细胞增殖的作用[10]。(3)Ras突变是肿瘤发生过程中经常发生的事件，他汀类药物可以抑制Ras蛋白翻译后修饰，干扰Ras活化，阻滞Ras信号传导，从而抑制细胞的增殖，并诱导细胞分化或凋亡。Park等[11]报道，洛伐他汀能够通过抑制Ras蛋白异戊二烯化抑制非小细胞肺癌细胞增殖。(4)半胱氨酸蛋白酶(Caspase)是细胞凋亡中起重要作用的一类蛋白水解酶，Caspase活化与凋亡的启动有关，Bcl-2则可阻碍细胞的凋亡过程。 Cho等[12]通过动物实验发现辛伐他汀可上调Caspase-3蛋白表达，下调Bcl-2表达，诱导HCT-116细胞的凋亡，且可明显抑制小鼠结肠癌移植瘤的生长。本实验中应用不同浓度的阿托伐他汀作用于HCT-116、SW-480和Caco-2结肠癌细胞，结果显示随着阿托伐他汀浓度的升高，对结肠癌细胞的生长抑制作用逐渐增强，相关分析结果显示两者呈正相关，证实阿托伐他汀呈剂量依赖性抑制结肠癌细胞的生长。

NK细胞是先天性免疫系统的重要组成部分，对靶细胞的识别无主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)限制性，NK细胞表面NKG2D可与细胞表面的模型MICA结合，通过NKG2D-MICA系统同时参与调节固有性免疫应答和适应性免疫应答，发挥杀伤效应， 这种调节机制在肿瘤免疫、自身免疫及抗感染免疫等领域得到了广泛的关注[13,14]。肿瘤细胞表达的MICA分子与NK细胞表面的NKG2D交联，可以促使NK细胞活化并产生穿孔素和颗粒酶裂解靶细胞,从而提高NK细胞对肿瘤的杀伤活性[15]。细胞在肿瘤的微环境或受病毒感染以后NKG2D表达可上调[16-18]， Pende等[19,20]研究发现，NK细胞对高表达MICA的肿瘤细胞杀伤活性明显高于低表达者或者阴性者，杀伤活性增强的机理可能与肿瘤细胞MICA等配体的表达上调诱导NK细胞的活化有关。本实验应用不同浓度阿托伐他汀作用48 h后的HCT-116、SW-480和Caco-2细胞与NK细胞配置成10∶1效靶比，发现NK细胞对HCT-116细胞的杀伤活性在阿托伐他汀5～10 μmol/L时显著高于对照组，对SW-480的杀伤活性在阿托伐他汀浓度5～20 μmol/L时较对照组显著升高，而对Caco-2的杀伤活性在阿托伐他汀2.5～20 μmol/L的4个浓度组中均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。证实阿托伐他汀可增强NK细胞对结肠癌细胞杀伤活性， 另外，实验结果显示阿托伐他汀能上调上述3株结肠癌细胞MICA/B的表达，推测阿托伐他汀提高结肠癌细胞表面活化型受体NKG2D的配体MICA/B表达可能与NK细胞的杀伤活性升高有关。

MHCⅠ类相关基因A( Major histocompatibility complex class Ⅰ chain related gene A,MICA) 是位于HLA-B 位点上游约46 kb的基因，具有丰富的多态性[21]，目前报道有85种MICA等位基因， 其编码产物介导细胞应激时的信号转导，该分子在正常细胞和组织中不表达， 但癌变、感染或应激状态可上调其表达,MICA具有免疫原性，是一种肿瘤相关性抗原[22]。 Li等[23]运用免疫组化检测82例卵巢癌患者肿瘤组织MICA/B表达，结果表明肿瘤组织中MICA/B表达率高达97.6 %, 而正常组织基本不表达。而Watson等[24]研究结果显示 结直肠癌MICA高表达可作为结直肠癌预后良好的指标之一。本实验资料显示不同浓度阿托伐他汀作用于结肠癌细胞48 h后，在阿托伐他汀浓度2.5 μmol/L及5 μmol/L组，HCT-116细胞MICA/B的表达率与对照组比较显著升高，SW-480细胞MICA/B表达率在阿托伐他汀10 μmol/L及20 μmol/L组显著高于对照组，而在2.5～40 μmol/L的5个浓度组均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，证实阿托伐他汀可以上调结肠癌细胞MICA/B的表达，增强其免疫原性，有利于NK细胞表面NKG2D受体的识别，提高NK细胞的杀伤活性。

本研究证实阿托伐他汀能抑制肿瘤细胞的增殖，相同药物浓度对NK细胞的生长无明显影响。阿托伐他汀能上调HCT-116、SW-480和Caco-2表达MICA/B，增强NKG2D受体识别MICA/B的能力，从而达到增强NK细胞杀伤肿瘤细胞的敏感性。为药物与NK细胞联合抗肿瘤提供了新的实验依据，但本实验中及一些其他研究均表明存在着药物剂量的依赖性，如何找到一种安全合适的剂量进行抗肿瘤治疗是后来者需要解决的问题。另既往相关研究及本实验均为体外实验，体内是否能达到同样的效果，有待进一步的研究。

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[收稿2015-11-20 修回2016-05-25]

(编辑 张晓舟)

Effect and mechanism of atorvastatin on cytotoxicity of human NK cells to colon cancer cells

JIHui-Chun，LIUJun-Quan，ZHOUYu，LIYi，CHENFu-Xing，FEISu-Juan.

SuqianFirstHospital，Suqian223800，China

Objective:To explore the mechanism of the cytotoxicity of human NK cells induced by atorvastatin to colon cancer cell lines.Methods: After colon cancer cells (HCT-116,SW-480,Caco-2) were cultured with different concentrations of atorvastatin,CCK-8 assay was used to assess the effect of atorvastatin on growth of colon cancer cells.The amplification of human NK cells was induced by SCGM medium in vitro.Automatic biochemical analyzer was applied to test the cytotoxicity of NK cells to colon cancer cells which cultured with different concentration of atorvastatin.FCM was used to detect the expression rate of MICA/B on the cells.Results: (1) The cultivation of NK cells: The proportion of NK cells attained to 93.1% from 4.5% after cultured for 10 days.(2) The effects of atorvastatin on the growth of the colon cancer cells: After cultured with atorvastatin,the inhibition rate of HCT-116 cells was higher than that in control when the density of atorvastatin increased from 5 μmol/L to 40 μmol/L after 48 h and from 1.25 μmol/L to 40 μmol/L after 96 h(P<0.05).Correlation analysis showed that the concentration of atorvastatin and the growth inhibition rate of HCT-116 cells were positively correlated(r[48 h]=0.13,r[96 h]=0.22,P<0.05).(3) The cytotoxicity of NK cells to colon cancer cells effected after atorvastatin: In different atorvastatin concentrations groups,the cytotoxicity of NK cells to three colon cancer cell lines was all higher than that in control(P<0.05).The atorvastatin concentration was from 2.5 μmol/L to 10 μmol/L for HCT-116 cells,from 5 μmol/L to 20 μmol/L for SW-480 cells,and from 2.5 μmol/L to 20 μmol/L for Caco-2 cells.Among the three cell lines,the cytotoxicity of NK cells to HCT116 was the highest in the same concentration.(4)NK cells by atorvastatin cutting statins 96 h,the concentration of 20 mmol/L and 40 mmol/L inhibition rate was higher than that of control group,more than other groups on NK cell growth without significant effect. (5) The impact of atorvastatin on MICA/B expression of colon cancer cells: After cultured with different concentrations of atorvastatin,the expression of MICA/B on colon cancer cells was higher than that in control(P<0.05).The concentration was 2.5 μmol/L and 5 μmol/L for HCT-116 cells,10 μmol/L and 20 μmol/L for SW-480 cells,and from 2.5 μmol/L to 40 μmol/L for Caco-2 cells. Conclusion: Atorvastatin could inhibit the growth of colon cancer cells (HCT-116,SW-480 and Caco-2) in a dose-dependent manner;and it could enhance the cytotoxicity of NK cells to colon cancer cells;it also could promote the expression of MICA/B of colon cancer cells,and improve the immunogenicity of colon cancer cells.

Atorvastatin;Colon cancer cell lines;Natural killer cells;MICA/B

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.004

①本文受南京军区医学科技创新课题经费资助项目(13MA039)资助。

姬会春(1982年-)，女，硕士，主治医师， 主要从事消化道肿瘤免疫治疗方面的研究，E-mail：48587581@qq.com。

及指导教师：费素娟(1963年-)，女，硕士，教授，硕士生导师，主任医师，主要从事消化系肿瘤的基础与临床研究，E-mail:feisj1031@yahoo.com.cn。

R735.3

A

1000-484X(2017)02-0178-08

②中国人民解放军97医院，徐州221000。

③徐州医学院附属医院消化科，徐州221000。