脐带间充质干细胞体外对脐带血CD4+T淋巴细胞免疫调节作用的研究

贡 波 徐志国 王绍红 程红玲 刘 超 闫铭杰

(浙江省脐带血造血干细胞库，协和华东干细胞基因工程有限公司，湖州313000)

脐带间充质干细胞体外对脐带血CD4+T淋巴细胞免疫调节作用的研究

贡 波 徐志国 王绍红 程红玲 刘 超 闫铭杰①

(浙江省脐带血造血干细胞库，协和华东干细胞基因工程有限公司，湖州313000)

目的：研究脐带间充质干细胞(UCMSCs)在体外对异源脐血CD4+T淋巴细胞增殖、凋亡及向CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)分化的免疫调控作用。方法：建立不同比例UCMSCs与植物血凝素(PHA)活化的脐血CD4+T淋巴细胞共培养，或与Transwell共培养体系，检测CD4+T淋巴细胞增殖情况、CD4+CD25+/CD4+比率的变化及调节性T淋巴细胞标志基因Foxp3相对表达量的变化。同时，建立UCMSCs与地塞米松(DXM)刺激的脐血CD4+T淋巴细胞共培养，或与Transwell共培养体系，检测CD4+T淋巴细胞凋亡情况。结果：PHA活化的脐血CD4+T淋巴细胞在与UCMSCs共培养3 d后，较无UCMSCs对照组相比，细胞数量明显减少(P<0.05)且CD4+CD25+/CD4+T淋巴细胞的比率及Foxp3的相对表达量显著增加(P<0.01)，并随UCMSCs数量增加，作用增强(P<0.05)。DXM诱导的脐血CD4+T淋巴细胞与UCMSCs共培养7 d后，细胞凋亡比率较无UCMSCs对照组显著降低(P<0.01)。上述效应在Transwell共培养中部分减弱但无法消除。结论：UCMSCs对脐血CD4+T细胞介导的免疫反应具有负调节作用,其作用主要表现在对细胞增殖能力和分化的调控而不是促进凋亡。

脐带间充质干细胞；脐血CD4+T细胞；CD4+CD25+调节性T细胞；增殖；分化；凋亡

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)来源于发育早期的中胚层，最初由Friedenstein等[1]从骨髓中发现。MSCs拥有的天然免疫调节作用，在体外表现出了非MHC限制性、剂量依赖性抑制T淋巴细胞反应的特性[2]，使其在器官移植、骨髓移植和自身免疫性疾病的防治中，发挥了重要作用[3,4]。

目前，自身免疫性疾病是继心血管疾病、癌症后威胁人类健康的第三大杀手，已被列入我国十类重大疾病之一。某些自身免疫性疾病，如重症肌无力(Myasthenia gravis，MG)、皮肌炎(Dermatomyositis，DM)等，对婴幼儿童造成的困扰远远超过成人。因此，研究MSCs对脐带血来源T细胞的免疫调节功能，对新生儿和儿童自身免疫性疾病的临床研究具有重要提示意义。

人脐带间充质干细胞(Human umbilical mesenchymal stem cells，hUCMSCs)与其他的成体干细胞相比，增殖分化能力更强，已成为难治性疾病潜在的治疗手段[5,6]。UCMSCs其在体外发挥抑制作用时没有MHC限制性[7]，能显著降低移植物抗宿主病(Graft versus host disease,GVHD)反应，且同种异源性UCMSCs有不引起副反应产生的特点[8]。hUCMSCs的培养及MSCs对成人外周血T淋巴细胞的调控研究已经为众多研究者报道[9-11]，但有关hUCMSCs对脐带血来源的免疫细胞调控作用的研究报道相对较少。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 ALyS505N-175培养基为日本细胞研究所产品；DMEM/F12培养基为Invitrogen产品；植物血凝素(Phytohemagglutinin，PHA)、地塞米松(Dexamethasone，DXM)为Sigma产品；胎牛血清(FBS)为Excell产品；淋巴细胞分离液(Ficoll，1.077 g/L)为深圳达科为生物技术股份有限公司生产；CD4+T细胞分选试剂盒(CD4+T Cell Isolation Kit)为美天旎产品；丝裂霉素C(Mitomycin C，MMC)为Roche产品；RNA提取试剂盒(Ultrapure RNA Kit)为北京康为世纪生物科技有限公司生产；逆转录试剂盒(ReverTra Ace qPCR RT Kit)、Real-time PCR试剂盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-)为日本TOYOBO产品；CD73-PE抗体、CD90-PE抗体、CD105-FITC抗体、CD29-PE抗体、CD44-PE抗体、CD31-PE抗体、CD34-PE抗体、CD45-FITC抗体、CD4-FITC抗体、CD25-PE抗体、凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC/PI)为美国BD产品。

1.1.2 样本来源 实验脐带及脐带血来源于浙江省脐带血造血干细胞库的捐献标本,HIV、HBV、HCV、CMV、梅毒螺旋体等检测均为阴性。

1.2 实验方法

1.2.1 UCMSCs的分离培养及表面标志检测 将脐带消毒后剪成2 mm3左右小块，置于细胞培养瓶中，加入15 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，5%CO2，37℃培养箱培养。取P3代细胞，将细胞密度调整为106个/ml，单抗(CD73-PE、CD90-PE、CD105-FITC、CD29-PE、CD44-PE、CD31-PE、CD34-PE、CD45-FITC)标记，流式细胞仪检测细胞免疫表型。

1.2.2 脐带血CD4+T(UCB-CD4+T)淋巴细胞的获取 采用Ficoll密度梯度离心法取得脐带血单个核细胞(UCB-MNC)后，用含10%胎牛血清的ALyS505N-175培养基将UCB-MNC调整至106个/ml，置培养瓶中37℃孵育30 min，收集未贴壁细胞，按CD4+T Cell Isolation Kit说明书操作，分选得到CD4+T淋巴细胞，流式细胞仪检测CD4表达量。收集贴壁的抗原提呈细胞(Antigen-presenting cells，APCs)，调整密度至104个/ml待用。

1.2.3 不同数量UCMSCs与PHA作用下的UCB-CD4+T细胞共培养 将达到80%融合的P3代UCMSCs分别以1×105个/孔和1×104/孔个两种数量接种于24孔培养板或Transwell小室中，2 h后加入终浓度10 μg/ml的MMC去增殖处理3 h。将分选得到的脐带血CD4+T淋巴细胞以1×106个/孔的数量接种至含UCMSCs的培养板中，同时每孔接种1×103个APCs，并加入终浓度为10 μg/ml的PHA。接触共培养1×105、1×104UCMSCs设为C1、C2组，Transwell 1×105、1×104UCMSCs设为D1、D2组，脐带血CD4+T细胞+PHA为对照组A，脐带血CD4+T细胞+UCMSCs为对照组B，各组均设6个复孔。

培养板置于37℃、5%CO2孵箱中连续培养3 d后，收集细胞PBS洗涤离心后，镜下计数。各组收集3个孔的细胞，洗涤后加入CD4-FITC、CD25-PE抗体各20 μl室温避光孵育30 min，PBS缓冲液混匀离心后，流式细胞仪检测CD4+CD25+表达。

各组收集3个孔的细胞提取总RNA，反转录得到cDNA后，进行Real-time PCR，检测调节性T细胞标志基因Foxp3表达量的变化，目标基因Foxp3引物F:AACAGCACATTCCCAGAGTTCCT，R:CATTGAGTGTCCGCTGCTTCT；内参基因GAPDH引物F:CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，R:ACGACCAAATCCGTTGACTC；在测定两个基因的扩增效率后，使用2-ΔΔCT法分析基因表达量的差异。

1.2.4 UCMSCs与DXM作用下UCB-CD4+T细胞共培养 将达到80%融合的P3代UCMSCs以5×104/孔的数量接种于24孔培养板或Transwell小室中，2 h后加入终浓度10 μg/ml的MMC增殖处理3 h。将分选得到的脐带血CD4+T淋巴细胞以5×105个/孔的数量接种至含UCMSCs的培养板中，并加入终浓度为10-5mol/L的DXM。设置无MSCs对照组A，24孔板实验组B，Transwell实验组C，同时设置不含DXM对照组1，含DXM实验组2，各组均设3个复孔。

培养板置于37℃、5%CO2孵箱中连续培养7 d后，PBS洗涤离心后将细胞调整至106个/ml，取200 μl细胞悬液加入5 μl的AnnexinV-FITC混匀避光，室温孵育15 min,加入5 μl的PI染色，补加200 μl PBS后流式检测细胞凋亡。

2 结果

2.1 UCMSCs的分离培养及流式细胞术检测 UCMSCs呈贴壁生长，流式结果显示高表达CD73、CD90、CD105、CD29和CD44，极少表达CD31、 CD34、CD45，说明细胞纯度较好，见图1。

2.2 共培养后细胞计数 在 PHA刺激下，可见细胞分裂活化聚集成团，形成明显的细胞团块。第3天进行细胞计数，实验组细胞数量均少于对照组A，且UCMSCs数量越多，细胞数量越少，在相同UCMSCs数量的前提下，Transwell共培养组细胞数多于接触共培养组。镜下细胞状态以一组实验为例见图2，细胞数量统计见图3。

2.3 流式测定CD4+CD25+细胞比例变化 脐血CD4+T细胞经PHA活化后，CD4+CD25+/CD4+比率比活化前明显升高，而经过与UCMSCs共培养3 d后，双阳性比率提高更为显著，效应与UCMSCs数量呈正相关，Transwell共培养组也呈现出相同趋势，但效应较接触共培养组弱。双标流式图以一组实验为例见图4，数据统计见图5。

图1 UCMSCs表型流式细胞术检测结果Fig.1 UCMSCs surface marker detected by flow cytometryNote: Cells were labeled with antibodies against human antigens CD73，CD90，CD105，CD29，CD44，CD31，CD34，CD45，as analyzed by FACS.

图2 共培养后各组CD4+细胞形态(×40)Fig.2 Morphology of CD4+ cells in each group after coculture(×40)

图3 共培养3 d后细胞计数结果Fig.3 Results of cell count after coculture for 3 daysNote: Group C2，Group D1 vs Group A，Group C2 vs Group C1，*.P<0.05；Group C1 vs Group A，Group D1 vs Group C1，**.P<0.01.

2.4 Real-time PCR测定Foxp3表达量的变化 通过Real-time PCR发现，各实验组目标基因Foxp3相对表达量均明显高于对照组A(P<0.01)，且UCMSCs的数量越多Foxp3基因的相对表达量越高(P<0.01)。在较高浓度MSCs组中，接触共培养与Transwell共培养也表现出了一定差异(P<0.05)，PCR扩增曲线及各组Foxp3基因相对表达量见图6。

2.5 UCMSCs对DXM作用下脐血CD4+T细胞凋亡的影响 UCMSCs对脐血CD4+T细胞早期凋亡和晚期凋亡均有明显抑制作用(P<0.01)，在早期凋亡组中接触共培养比Transwell共培养具有更为明显的抑制能力(P<0.01)。凋亡流式图以一组实验为例见图7，凋亡率统计及分析见图8。

图4 共培养3 d后各组CD4CD25双标流式检测结果Fig.4 Results of flow cytometry double marked assay in each group after coculture for 3 days

图5 共培养3 d后各组细胞CD4+CD25+/CD4+比率(%)Fig.5 Rate of CD4+CD25+/CD4+ in each group after coculture for 3 days(%)Note: Group C2 vs Group A，Group D2 vs Group D1，*.P<0.05；Group C1 vs Group A,Group D1 vs Group A,Group C2 vs Group C1，Group D1 vs Group C1，**.P<0.01.

图6 目标基因Foxp3的PCR扩增曲线及2-ΔΔCT法计算的各组相对表达量的变化Fig.6 PCR amplification curve of target gene Foxp3 and 2-ΔΔCT method to calculate change of relative expression of each groupNote: Group D1 vs Group C1，*.P<0.05；All groups vs Group A，Group C2 vs Group C1，Group D2 vs Group D1，**.P<0.01.

图7 共培养7 d后各组流式凋亡检测结果Fig.7 Results of apoptosis by flow cytometry assay in each group after coculture for 7 days

图8 共培养7 d后各组凋亡率分析Fig.8 Apoptosis rate analysis in each group after coculture for 7 daysNote: Early apoptosis Group B2,Group C2 vs Group A2，Group C2 vs Group B2；Late apoptosis Group B2,Group C2 vs Group A2，**.P<0.01.

3 讨论

调节性T细胞(Treg)是T细胞中的一个特殊亚群，它们能够抑制免疫系统的激活，对维持自身抗原的耐受和免疫细胞群体的稳态具有重要意义。CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞来源于胸腺，对自身反应性T细胞具有抑制作用，在GVHD的预防和治疗中起到了至关重要的作用，因此，我们在研究UCMSCs对脐血淋巴细胞免疫调控的研究中，重点关注对CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的调控。为了避免其他亚群淋巴细胞的干扰，我们选用经免疫磁珠分选纯化过的CD4+T淋巴细胞用于本次研究。

有研究发现，T细胞的增殖可被MSCs抑制，这种作用与多种趋化因子如CXCR3、VCAM-1和ICAM-1等的高表达相关[12]，另外，抑制性分子PD-1及其配体在MSCs抑制T淋巴细胞增殖的过程中也发挥了一定作用[13]。还有报道表明，MSCs可促进CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的产生[14]。MSCs表达Notch1配体Delta-like ligand(DLL)1、3、4及Jagged1、2，Notch1信号活化可诱导CD4+T淋巴细胞向Treg分化[15]。另一研究证实，MSCs能够分泌血红素氧合酶(Hemeoxygenaes-1，HO-1)，对高表达IL-10的Treg(Tr1)产生重要的诱导作用，但目前尚不清楚这一作用的明确机制[16]。

本研究显示，与UCMSCs的共培养后由PHA刺激的脐血CD4+T淋巴细胞增殖受到了明显抑制，且UCMSCs数量越多，这种抑制作用越强，呈正相关。同时，通过Transwell培养板将UCMSCs和脐血CD4+T淋巴细胞分隔共培养，这种抑制增殖趋势相似，但大大减弱了抑制增殖的效果，在高浓度UCMSCs存在时与接触培养组呈显著差异(P<0.01)，提示细胞间的直接接触，抑制了CD4+T淋巴细胞的增殖，并且起到了主要作用。通过凋亡实验我们发现，UCMSCs对脐血CD4+T细胞早期凋亡和晚期凋亡均有明显的抑制作用，其中两种细胞接触共培养比Transwell共培养具有更为明显的抑制能力。另外，经PHA活化的脐血CD4+T细胞与UCMSCs共培养3 d后，CD4+CD25+双阳性细胞比率显著提高，与UCMSCs数量呈正相关。同时，在较高浓度MSCs组中，Transwell共培养组双阳性比率低于接触培养组(P<0.01)，但也显著高于对照组A(P<0.01)，提示可溶性细胞因子也促进了CD4+CD25+双阳性细胞的产生。通过对调节性T细胞的标志性分子叉状头转录因子Foxp3的Real-time PCR检测，显示各实验组相对于对照组A，Foxp3基因的表达量显著上升(P<0.01)，趋势与流式CD4+CD25+双阳性细胞比率的升高基本一致。说明UCMSCs的存在，确实提高了CD4+T细胞中CD4+CD25+调节性T细胞的比率。

UCMSCs对脐血CD4+T细胞存在免疫抑制效应，这种效应一方面表现在显著抑制脐血CD4+T细胞的增殖，从而减少免疫应答的产生；另一方面，UCMSCs诱导了CD4+T细胞向CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分化，而CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞也具有负免疫调控的作用。这两种调控效应均与UCMSCs数量呈正相关，并且通过细胞与细胞接触及释放可溶性细胞因子实现。另外，UCMSCs对脐血CD4+T细胞的抑凋亡作用，也说明了免疫抑制效应主要集中在对细胞功能和分化的调控而不是促进凋亡。UCMSCs对脐血CD4+T细胞存在的免疫抑制效应，为新生儿和儿童自身免疫性疾病及GVHD的临床研究，提供了新的思路。

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[收稿2016-08-04]

(编辑 倪 鹏)

Immunoregulation study of UCMSCs on UCB CD4+T lymphocytes in vitro

GONGBo,XUZhi-Guo,WANGShao-Hong,CHENGHong-Ling,LIUChao,YANMing-Jie.

ZhejiangProvinceUmbilicalCordBloodStemCellBank，EasternUnionStemCellGeneEngineeringCo.Ltd.,Huzhou313000,China

Objective:Immunoregulation study of umbilical mesenchymal stem cell (UCMSCs) on allogeneic umbilical cord blood(UCB) CD4+T lymphocytes,which proliferation,apoptosis and the differentiation to CD4+CD25+regulatory T cell (Treg) in vitro.Methods: Establishing on direct contact or transwell co-culture system,adopt in different proportion of UCMCs with phytohaemagglutinin (PHA)-activated UCB CD4+T lymphocytes were co-cultured.The proliferation of lymphocyte,percent of CD4+CD25+/CD4+and Foxp3 expression,regulatory T cell marker gene were measured.Apoptosis of CD4+T lymphocytes were observed in the direct contact or transwell coculture system of UCMSCs with desamethason(DXM)-stimulated UCB CD4+T lymphocytes.Results: The UCB CD4+T lymphocytes cocultured with UCMSCs with PHA-activating for 3 days，compared with the UCMSCs free control group，the amount of cells was reduced noticeably(P<0.05) and the percent of CD4+CD25+in CD4+T lymphocytes and Foxp3 expression significantly increased(P<0.01) in a dose dependent way(P<0.05).The UCB CD4+T lymphocytes cocultured with UCMSCs with DXM-inducing for 7 days，the apoptosis rate was significantly lower than that of the control group without UCMSCs (P<0.01).These effects were partially attenuated in transwell coculture but could not be eliminated.Conclusion: UCMSCs are negative effect on UCB CD4+T lymphocytes-mediated immunity effects,and mainly manifested in the regulation on cell proliferate ability and differentiation rather than promoting apoptosis.

Umbilical cord mesenchymal stem cells (UCMSCs);Umbilical cord blood CD4+T lymphocytes;CD4+CD25+regulatory T cell;Proliferation;Differentiation;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.012

贡 波(1985年-)，男，硕士，中级工程师，主要从事脐带间充质干细胞分离培养、生物学特性及免疫调控功能的研究，E-mail:gongbo-1019@163.com。

及指导教师：徐志国(1979年-)，男，硕士，副高级工程师，主要从事脐带血造血干细胞库的建设和质量运行、脐带间充质干细胞的临床研究, E-mail:huadongstemcell@163.com。

R392.12

A

1000-484X(2017)02-0220-06

①中国医学科学院血液学研究所，天津300020。