刺葡萄紫秋远缘杂交胚挽救技术研究

周俊，罗智勇*，廖晓珊，文斌，谭竟，黄涛，周雷

（株洲市农业科学研究所，湖南株洲 412007）

刺葡萄紫秋远缘杂交胚挽救技术研究

周俊，罗智勇*，廖晓珊，文斌，谭竟，黄涛，周雷

（株洲市农业科学研究所，湖南株洲 412007）

采用胚挽救技术对湖南野生刺葡萄品种进行远缘杂交育种，以期得到刺葡萄三倍体新种质。通过不同培养基以及不同取样时间的试验，得出最适基本培养基为改良B5；取样时间以授粉50～55 d为宜。以四倍体为母本的组合胚培养成苗率较高，其中巨峰×紫秋杂交的成苗率最高，达22.8%。

刺葡萄；紫秋；远缘杂交；胚挽救

胚挽救是在胚败育前将胚珠取出进行离体胚珠内胚培养，阻止胚的败育，从而使不成熟合子胚继续发育并在离体条件下萌发成苗[1]。二倍体与四倍体葡萄杂交是获得三倍体无核葡萄最有效的方法，但是二倍体和四倍体杂交的最大障碍是亲和力差，坐果率低，杂种胚早期败育或胚乳解体，获得的三倍体杂交种子生活力低，很难得到杂交后代，运用胚挽救技术能获得较多的杂交后代，并在其中筛选三倍体杂种[2]。

刺葡萄属东亚种群，是我国主要野生葡萄种群之一，为二倍体[3]，其抗逆性强、丰产性好，但籽多，籽与肉囊较难分离，鲜食品质较低。本试验以二倍体刺葡萄与四倍体欧美杂种葡萄进行远缘杂交，利用胚挽救技术可获得三倍体新种质，为无核葡萄育种提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

试验于2011-2015年在株洲市农业科学研究所进行。利用二倍体刺葡萄品种紫秋与不同四倍体葡萄杂交，杂交组合见表1。

表1 杂交组合

父本花粉采集于初花期进行，取出花药于干燥处晾干，待花药开裂、花粉散出后收集于玻璃瓶中储存。

母本花前3～4 d去雄。去雄时选择生长正常的结果枝，每枝留1个花序，根据母本品种不同每花序留30～50朵花。为防止去雄时花粉落到柱头上造成自交，每次去雄后立即套袋。去雄后两天左右，待柱头上出现粘液时，分1～2次授粉（用毛笔沾取花粉刷在带粘液的柱头上），每组合授粉20～25穗。

1.2 培养基的筛选

胚珠培养基：Nitsch+GA30.3 mg/L+60 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，调pH5.8，培养室温度25 ℃±2 ℃，培养30 d左右以后，将胚从胚珠中剥出，放入胚培养基中使其萌发成苗。胚培养基分别使用MS、1/2MS和改良B5，每种培养基均添加IAA 0.5 mg/L+GA30.3 mg/L+60 g/L蔗糖，调pH5.8，培养室温度25 ℃±2 ℃，2500Lx照度每天照光14 h。

统计萌发率，胚萌发率/%=萌发胚数/接种胚珠数×100。

成苗率：正常苗数占接种胚珠数的百分率。

1.3 取样时间的选择及接种

从授粉后45 d开始，每隔5 d取样一次，取样3次。每个组合取杂交果实30～35个，葡萄样品先用75%酒精溶液浸泡20 s，然后用0.1%升汞消毒15 min，再用无菌水清洗3～4次。在无菌条件下采用Nitsch培养基进行胚珠离体培养，培养30 d以后，将胚从胚珠中剥出。胚接种在改良B5培养基中，胚萌发后分批统计萌发率，分析不同取样时间对胚萌发率的影响。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对胚发育率的影响

以紫秋×巨峰的杂交胚为试材对MS、1/2MS、改良B5基础胚培养基进行筛选，发现基本培养基成分对植株形成率影响显著。在添加相同浓度的生长调节物质的条件下（IAA 0.5 mg/L），1/2MS培养基效果最差，成株率仅为5%；MS略高，为6.4%；改良B5效果最好，成株率达到29%（表2）。与赵艳华等[4]的研究结果一致。

2.2 不同取样时间对胚萌发率的影响

在胚挽救过程中，取样时期的确定是影响胚挽救成功率的关键因素之一。由于胚挽救的杂交亲本材料不同，胚败育的时期和方式也可能不同[6]，所以胚挽救的取样时期也应该存在差异。因此确定刺葡萄杂交后代胚挽救最佳取样时间非常重要。

刺葡萄紫秋是晚熟品种，醉金香、巨峰、香悦为中熟品种，杂交后代胚败育较晚，本试验从授粉后45 d开始，每隔5 d取样一次，以确定胚挽救最佳的取样培养时期。

如表3所示，以紫秋为母本的杂交组合，授粉后50～55 d，胚萌发率较高，其中紫秋×巨峰组合的取样时间在55 d的胚萌发率最高，达42.62%；而以紫秋为父本的3个组合中，醉金香×紫秋杂交组合的取样时间在45 d为最高，胚萌发率达到32.56%。总的来看，在授粉后50 d，随着接种时间的推迟，胚珠的发育率不断提高。

表2 基本培养基对紫秋×巨峰杂交组合胚发育率的影响

表3 不同取样时间对胚萌发率的影响

表4 不同杂交组合的杂交胚培养

2.3 不同组合的胚培养

将不同杂交组合在不同培养基、不同取样时间试验中的胚珠接种总数、胚萌发总数、胚萌发率和成苗率进行统计。如表4所示，以四倍体为母本的组合胚培养成苗率较高，分别为22.8%、19.01%和22.02%；以二倍体为母本的组合成苗率相对较低，分别为5.46%、6.84%和8.33%。相同的两个品种杂交，以四倍体为母本胚培养的成苗率高于以二倍体为母本的杂交组合。

3 讨论

胚在正常情况下能发育成熟，播种后能发育成完整的植株。但是，在不同倍性间杂交胚的发育中，胚往往出现中途败育或退化[7-8]，这极大地降低了育种效率。王爱玲等[9]认为，不同培养基作为胚挽救成功的重要外界条件，创造幼胚发育的良好外在条件可以提高胚的发育率和成苗率，并且氨基酸在胚珠发育培养基中的作用早已引起许多学者的广泛关注[5]。胚挽救技术能有效地提高葡萄杂交育种效率，是育种中基因重组的有力桥梁，使可能败育或将要败育的胚经过适宜的培养，获得再生植株，这对加快葡萄的杂交育种进程具有重要意义。

刺葡萄耐高温高湿、低光照和高抗病性，在南方已有多年的栽培历史，在湖南刺葡萄资源非常丰富[3]。本研究旨在将丰富的刺葡萄资源加以利用，将刺葡萄与优良的欧美种葡萄进行杂交，以期得到适合湖南露地栽培杂交新品种，降低设施成本及生产中农药化肥的使用。本研究通过对取样时间的确定，基本培养基的选择及对不同杂交组合进行杂种胚培养，已得到适合刺葡萄远缘杂交胚挽救的适合方法，期望得到刺葡萄三倍体杂交新品种。本试验采用胚挽救技术培养三倍体杂种，极大的提高了刺葡萄优质资源的利用，拓宽了刺葡萄育种的范围，缩短了育种年限。下一步，我们将对杂种幼苗进行分子倍性鉴定。

[1] 王飞, 王跃进, 周会玲, 等. 无核葡萄与中国野生葡萄杂种胚发育和败育的细胞学研究[J]. 西北农林科技大学学报: 自然科学版, 2005, 33(3): 61-65.

[2] 郭印山, 高秀岩, 赵玉辉, 等. 金星无核葡萄胚挽救技术研究初报[J]. 中外葡萄与葡萄酒, 2004(3): 6-8.

[3] 石雪晖, 杨国顺, 刘昆玉, 等. 湖南省刺葡萄种质资源研究进展[J]. 中外葡萄与葡萄酒, 2014(4): 47-49.

[4] 赵艳华, 程和禾, 吴雅琴, 等. 三倍体葡萄种质创新及倍性快速鉴定[J]. 园艺学报, 2011, 38(6): 1161-1166.

[5] 孙马, 王跃进. 中国野生葡萄染色体倍性研究[J]. 西北农业学报, 2006, 15(6): 148-152.

[6] 徐海英, 闫爱玲, 张国军. 葡萄二倍体与四倍体品种间杂交胚挽救取样时期的确定[J]. 中国农业科学, 2005, 38(3): 629-633.

[7] 陈香波, 曹孜义. 离体葡萄未成熟胚成苗途径研究[J]. 果树科学, 2000, 17(4): 261-264.

[8] 董晓玲, 贺普超. 无核葡萄杨格尔的胚发育及胚珠培养[J]. 果树科学, 1991, 8(2): 87-90.

[9] 王爱玲, 王跃进, 唐冬梅, 等. 提高无核葡萄胚挽救中幼胚成苗率的研究[J]. 中国农业科学, 2010, 43(20): 4238-4245.

Study on distant hybridization and embryo rescue technique of Vitis davidii Foёx Ziqiu

ZHOU Jun, LUO Zhiyong*, LIAO Xiaoshan, WEN Bin, TAN Jing, HUANG Tao, ZHOU Lei
(Zhuzhou Institute of Agricultural Sciences, Zhuzhou 412007)

In order to obtain new triploid germplasm, Vitis davidii Foёx Ziqiu were chosen to cross with tetraploid (European and American Hybrid), the acquired ovules were cultured by the embryo rescue technique. The different media and sampling time were investigated. The result showed that modified B5 was better as base medium, 50～55 days after pollinating were suitable sampling time. The cross combinantion by tetraploid(Koyho) as female parent got a higher seedling rate, it's 22.8%.

Vitis davidii Foёx; Ziqiu; distant hybridization; embryo rescue

S663.1

A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.01.006

2016-10-13

湖南省市自然科学联合基金（2016JJ5040）

周俊（1983-），男，硕士学位，主要研究刺葡萄杂交育种、刺葡萄酿酒。

*通讯作者：罗智勇（1972-），男，本科学历，主要研究水果育种与栽培、刺葡萄酿酒。E-mail: 280029425@qq.com