基因编辑神器——CRISPR技术

黄俊骏 王华华 候俊杰 梁卫红

(河南师范大学生命科学学院 新乡 453007)

1 什么是CRISPR

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是指基因序列上成簇的规律间隔的短回文重复序列。CRISPR本身是大多数细菌及古细菌中的一种防御系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。在这些生物基因组中的CRISPR位点上能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达CRISPR相关酶(核酸酶Cas)，它能靶向切割病毒DNA，进而阻止病毒完成其功能[1]。可以说，CRISPR就是一把“分子剪刀”，能够剪断DNA分子。

2 何谓CRISPR技术

此前多种基因编辑技术(例如，ZFN/TALEN技术[2]、RNAi技术)已经得到广泛应用。而CRISPR技术因相对较为简单、廉价和高效，而且可以多处打靶，逐渐处于基因编辑技术领域的统治地位。

目前，科学家使用的CRISPR技术是由最简单的type II CRISPR改造而来，由有核酸内切酶活性的Cas9蛋白和单链的导向RNA组成[3]。通过核酸内切酶蛋白Cas9引起DNA双链的断裂，而细胞通过非同源末端连接(NHEJ)的修复会造成插入和缺失(INDEL)效应，进而造成基因的移码突变而达到基因敲除的目的[2]。

3 如何使用CRISPR技术

将细菌的天然免疫防御系统CRISPR用于其他非细菌细胞时需要满足两个条件：①核酸酶Cas蛋白，用于切断目的基因中的靶向DNA片段；②导向RNA的RNA分子，它既能通过互补靶向DNA结合目的基因，又能与核酸酶Cas蛋白形成复合物，进而指导核酸酶Cas蛋白到达正确的剪切位点[4]。因此，在整个基因编辑的过程中，只需要导入编码向导RNA和Cas蛋白的质粒即可。一旦在细胞中表达了向导RNA和Cas9蛋白，那么这一复合物就能完成余下的工作，轻而易举地切断靶向DNA的两条链。

目前，科研人员已经研发出各种各样的载体来满足不同的生物体系，可直接从Addgene公司网站上查询和选择合适的CRISPR/CAS系统[5]。同样，在目的基因靶向DNA区域选择合适的位点时，也可从相关的的网站上[6]进行查询。然后研究人员可通过改变Cas活性，或结合其他元件，来达到调整这种工具在基因校正和基因调控方面作用的目的。

4 CRISPR技术有哪些应用

CRISPR技术已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造，例如，Zhang等人将编码Cas9蛋白的mRNA和两条向导RNA分子直接注入小鼠的受精卵细胞中，成功地敲除了两个基因，成功率达到了80%，并且只需要数周的时间[7]；中国科学院北京遗传及发育生物学研究所Gao的团队利用CRISPR技术已经成功地使OsPDS等4种水稻基因失活，该研究首次证实CRISPR-Cas系统能够用于植物的基因组编辑；随后又利用该技术将小麦中的TaMLO基因敲除，得到耐白粉病的小麦新品种[8]。 Zhang等人最近又构建出一种新的小鼠模型，简化了CRISPR-Cas9系统在体内基因组编辑实验中的应用，并且构建出最致命的一种人类癌症——肺腺癌的模型[9]。

5 CRISPR技术有何意义

CRISPR技术从2012年底出现至今，可谓是生物界的焦点。CRISPR技术相对于RNAi、ZFN/TALEN等基因打靶技术来说，具有更简便、更经济等优势，应用越来越广泛。一般的实验室都可以自主构建平台，为研究者解析生物基因功能提供了一种更加有效的办法。2014年，《自然·方法》杂志在十周年之际推出纪念特刊，点评了在过去十年中对生物学研究影响最深的十大技术，CRISPR赫然上榜。CRISPR技术让人们从全新的角度去认识微生物中内在和相互之间的调控网络和调控机制，认识原核细胞和真核细胞之间的联系和异同，甚至获得协同进化的证据。随着CRISPR技术在人类医疗和农业生产的潜在应用价值的提升，这个技术还由于可能被用来培育和设计婴儿、治疗遗传病或解决人类进化过程中的缺陷而引发社会的广泛关注。例如，早在20世纪70年代末，科研人员就已经能够通过大肠杆菌进行胰岛素的生产，这意味着基因编辑技术在生物医学领域存在巨大的应用潜力；人类基因组测序早已于2005年完成，但关于人类绝大多数的基因的具体功能和作用的研究并没有取得突破性的进展，瓶颈就在于当时的基因编辑技术操作过程太过复杂、耗费昂贵等，而这一切都将因为CRISPR技术的出现而发生巨大的改变。