凝血与补体级联反应信号通路对艾滋病湿热内蕴证发病的影响

张海燕,张 淼,吕顺武,高 亮,李建智,谢世平*

·论著·

凝血与补体级联反应信号通路对艾滋病湿热内蕴证发病的影响

张海燕1,张 淼1,吕顺武2,高 亮1,李建智1,谢世平1*

目的 明确艾滋病湿热内蕴证蛋白水平的表达差异，探索凝血与补体级联反应信号通路在中医证候实质中所主导的作用。方法 2014年8月根据整群随机抽样原则，纳入艾滋病患者48例(艾滋病肺脾气虚证25例为艾滋病肺脾气虚证组，艾滋病湿热内蕴证23例为艾滋病湿热内蕴证组)，并以同地区人口资料相似的非HIV感染者16例为对照组，采集所有受试者血清进行iTRAQ技术研究，将差异蛋白进行通路注释。结果 艾滋病湿热内蕴证组与艾滋病肺脾气虚证组相比，α1-抗胰蛋白酶、补体C4结合蛋白(C4bp)表达下调；艾滋病湿热内蕴证组与对照组相比，α1-抗胰蛋白酶、补体C4bp、α-2巨球蛋白、人结合丝氨酸凝集素蛋白酶2表达上调，补体C1r subcomponent、补体因子B及载脂蛋白B variant表达下调。这些差异蛋白均存在于凝血与补体级联反应信号通路。结论 艾滋病湿热内蕴证的发病机制可能是通过凝血与补体级联反应信号通路实现的，该信号通路上的差异蛋白点可作为艾滋病临床治疗的潜在用药靶点。

获得性免疫缺陷综合征；湿热；蛋白质组学

张海燕,张淼,吕顺武，等.凝血与补体级联反应信号通路对艾滋病湿热内蕴证发病的影响[J].中国全科医学，2017，20(6)：694-698.[www.chinagp.net]

ZHANG H Y,ZHANG M,LYU S W,et al.Impact of signal path of coagulation and complement cascades reaction for AIDS patients with syndrome of interior dampness-heat[J].Chinese General Practice，2017，20(6)：694-698.

蛋白质组学在临床诊断、药物筛选与研发、个性化医疗、生物学标志物及病理机制研究方面已取得了巨大成就，基于质谱的定量蛋白质组学可以精确测量多个蛋白的表达变化，从而使蛋白水平客观量化中医证候成为可能。蛋白是动态变化的，并不孤立行使功能，蛋白间的相互作用与生命活动密不可分，它们之间的活化调节与信号转导使蛋白构成网状关系图，成为信号通路。蛋白信号通路是生物学研究转折性的突破。在中医证候的生物学研究中，信号通路在证候的演变中发挥了重要媒介作用。本研究对艾滋病患者血清基于iTRAQ的蛋白质组学研究发现，凝血与补体级联反应信号通路可能是艾滋病湿热内蕴证的重要发病途径，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 根据整群随机抽样原则，2014年8月于某艾滋病高发村庄选取艾滋病患者，均填写艾滋病中医证候诊断量表(见表1、2)，量表的制定依据前期大样本中医证候流行病学调查结果[1]，共纳入艾滋病肺脾气虚证患者25例为艾滋病肺脾气虚证组、艾滋病湿热内蕴证患者23例为艾滋病湿热内蕴证组及同地区人口资料相似的非HIV感染者16例为对照组。3组性别、年龄、CD4、CD8、自然杀伤(NK)细胞比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表3)。

1.2 纳入标准 (1)艾滋病诊断标准参照中华医学会感染病学分会艾滋病学组颁布的《艾滋病诊疗指南(2011版)》[2]；(2)艾滋病肺脾气虚证和艾滋病湿热内蕴证患者诊断量表积分≥20分；对照组受试者HIV抗体初筛阴性，且连续3个月无高危性行为；(3)年龄16～60岁；(4)签署知情同意书。

1.3 排除标准 (1)不能配合调查；(2)有精神性疾病或重大脏器器质性疾病。

1.4 血清样本的制备 清晨用一次性采血针和EDTA抗凝管抽取所有受试者空腹静脉血5 ml，上下颠倒混匀5 次后置于4 ℃便携式低温冰箱中运输到实验中心样本处理间，将所有样本放入37 ℃恒温箱中温育30 min，运用Eppendorf 5810R离心机(2 500 r/min,离心10 min)收集血清2 ml。将每组血清均匀混合为4个待测样本(每个混合样本80 μl)，3组共计12个混合样本。采用安捷伦科技有限公司供应的Human 14多重亲和去除小柱去除血清样本的高丰度蛋白(严格按照说明书操作)。

1.5 iTRAQ标记 将低丰度蛋白浓缩定量、酶解后用可见紫外分光光度计测定滤液OD280值进行肽段定量[3]，定量后的肽段用iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit(Applied Biosystems)进行标记。

表1 艾滋病肺脾气虚证诊断量表

Table 1 Diagnosis scale for syndrome of Qi deficiency of lung and spleen of AIDS

症状体征症状分级0无1轻2中3重权重系数症状积分动则气喘5易感冒4自汗3泄泻3恶风寒2胸闷2证候名称咳痰清稀2便溏2心悸□是□否1舌胖大□是□否1舌质淡□是□否1舌苔白□是□否1脉虚或弱□是□否1总积分总积分≥20分即可成立

表2 艾滋病湿热内蕴证诊断量表

表3 3组一般资料比较

注：NK细胞=自然杀伤细胞；a为χ2值

2 结果

2.1 差异蛋白显著性分析 艾滋病湿热内蕴证组与艾滋病肺脾气虚证组相比，α1-抗胰蛋白酶、补体C4结合蛋白(C4bp)表达下调；艾滋病湿热内蕴证组与对照组相比，α1-抗胰蛋白酶、补体C4bp、α-2巨球蛋白、人结合丝氨酸凝集素蛋白酶2表达上调，补体C1rsubcomponent、补体因子B及载脂蛋白Bvariant表达下调(见表4、5)。

表4 差异蛋白基本信息

注：C4bp=C4结合蛋白

本文创新点/不足：

(1)从分子生物学角度对艾滋病中医证候的发病机制进行了探索；(2)尚需要大样本的研究数据来做进一步的支撑。

表5 差异蛋白显著性分析

注：REF指内参标准品

2.2 信号通路 艾滋病湿热内蕴证组的血清差异蛋白均在凝血与补体级联反应信号通路发挥生物学活性(见图1，本文图1彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。

3 讨论

中医学认为，艾滋病病因为艾毒，具有湿毒特性，湿热证是艾滋病患者的主要证型之一，近年学术期刊文章不断证明，湿热证候在生物学水平主要累及炎性因子或蛋白[5]。刘德芳等[6]、李小民[7]研究发现湿热型类风湿关节炎患者血清中白介素6(IL-6)、白介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎性因子表达水平明显高于对照组。郝平生等[8]由质谱数据得出湿热证银屑病患者血清中的补体类、脂蛋白与免疫球蛋白等表达明显区分于正常对照组。孙校男等[9]通过结肠癌湿热证候的血清蛋白质组学分析与Western blotting验证，并综合多位学者的实验数据，认为中医证候与炎症、免疫类蛋白质密切相关。本文从蛋白质组学角度分析艾滋病湿热内蕴证的病理演变，以证实信号通路在艾滋病中

注：绿色高亮显示为目标蛋白

图1 目标蛋白通路注释图

Figure 1 Annotation map of target protein pathway

医证候发病机制中发挥重要作用。

本研究结果发现，艾滋病湿热内蕴证组与艾滋病肺脾气虚证组相比，血清α1-抗胰蛋白酶、补体C4bp表达下调；艾滋病湿热内蕴证组与对照组相比，α1-抗胰蛋白酶、补体C4bp、α-2巨球蛋白、人结合丝氨酸凝集素蛋白酶2表达上调，补体C1r subcomponent、补体因子 B及载脂蛋白Bvariant表达下调。

补体C4具有中和病毒的生物学活性，甚至直接中和RNA肿瘤病毒。补体C4bp是一种可溶性血浆糖蛋白，是补体激活经典途径中一个重要调节蛋白，控制着补体C3与补体C5转化酶合成与活性。研究发现补体C4bp在IgA肾病、小儿紫癜性肾炎血清中表达升高[10-11]。

α1-抗胰蛋白酶在胆管癌、恶性胰岛素瘤、胃癌、肝细胞癌等组织中表达升高，在体外应用α1-抗胰蛋白酶可以抑制胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞的增殖[12]，α1-抗胰蛋白酶的遗传性缺陷可引发肝病、早发性肺气肿等疾病[13]。研究发现α1-抗胰蛋白酶与胰岛素竞争结合清蛋白，在2型糖尿病、妊娠期糖尿病患者中普遍存在α1-抗胰蛋白酶表达降低[14-15]。

α-2巨球蛋白是一种广泛的蛋白酶抑制剂，在体外实验中可明显抑制胃腺癌细胞的迁移[16]。研究发现小儿哮喘急性发作时血清α-2巨球蛋白水平降低，且与病情危重程度呈负相关[17]，另外在骨关节炎发展进程中α-2巨球蛋白也起着不可替代的作用[18]。

这些炎症或免疫类差异蛋白均存在于凝血与补体级联反应信号通路，是内源性凝血激活途径和经典补体激活途径的重要调节蛋白。众所周知，在细胞信号传导中蛋白并不是孤立存在和作用的，众多的蛋白在同一条生化反应途径中执行各自的生理功能，不同的蛋白信号通路通过某个蛋白媒介又相互联系，在凝血与补体级联反应信号通路中，α-2巨球蛋白与SERPINA1基因编码的差异蛋白α1-抗胰蛋白酶抑制血纤维蛋白凝血酶原的生成，从而抑制纤维蛋白凝块降解。C4bp抑制补体C2与补体C4的生成和复合，从而调控补体C5R1与补体C3AR1的生成，最终间接作用于炎性反应、巨细胞聚合等；或者通过抑制补体C3转化来控制CR2与CR1的生成，从而间接作用于B细胞受体信号通路。

综上所述，艾滋病湿热内蕴证发病机制可能通过凝血与补体级联反应信号通路实现，该信号通路上的差异蛋白点可作为艾滋病临床治疗的潜在用药靶点。另外该信号通路的下游B细胞受体信号通路的间接激活可能是艾滋病湿热内蕴证发病的另一路径或靶向治疗的关注点。

作者贡献：张海燕进行研究设计与实施，撰写论文并对文章负责；吕顺武、高亮进行试验操作；张淼负责试验评估；李建智进行资料收集；谢世平进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：崔莎)

Impact of Signal Path of Coagulation and Complement Cascades Reaction for AIDS Patients with Syndrome of Interior Dampness-heat

ZHANGHai-yan1,ZHANGMiao1,LYUShun-wu2,GAOLiang1,LIJian-zhi1,XIEShi-ping1*

1.HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046,China2.LuoyangNo.1HospitalofTCM,Luoyang471000,China

Objective To make clear the expression differences of the protein levels in the syndrome of interior dampness-heat of AIDS,and explore the role of signal path of coagulaton and complement cascades reaction in the nature of TCM syndrome.Methods By random cluster sampling principle,48 AIDS patients(25 with syndrome of Qi deficiency of lung and spleen of AIDS was Qi deficiency of lung and spleen of AIDS group,23 with syndrome of interior dampness-heat of AIDS was interior dampness-heat of AIDS group) were enrolled in October 2014,and non HIV infected individuals with similar demographic data in the same area were taken as the control group.The serum samples of all the subjects were studied with iTRAQ techniques,and the differential proteins were annotated by signal pathway.Results Compared with Qi deficiency of lung and spleen of AIDS group,the expression of α1-antitrypsin and complement C4bp was down-regulated in interior dampness-heat of AIDS group.Compared with the control group,the expression of α1-antitrypsin,complement C4bp,α-2 macroglobulin and human-binding serine lectin protease 2 was up-regulated and the expression of C1r subcomponent complement,complement factor B,apolipoprotein B variant was down-regulated in interior dampness-heat of AIDS group.These proteins activated in coagulation and complement cascades reaction signal path.Conclusion The pathogenesis of AIDS patients suffering from syndrome of dampness-heat may be achieved through coagulation and complement cascades reaction signal path,and the differential proteins in this signal path can be used as potential drug targets for clinical treatment of AIDS.

Acquired immunodeficiency syndrome;Dampness-heat;Proteomics

国家十二五重大专项——HIV/AIDS中医证候转录组学研究(2012ZX10005001-005)；河南省高等学校重点科研项目——基于差异基因建立HIV/AIDS湿热内蕴证判别模型(15A360038)；河南中医学院博士科研基金——艾滋病中医发病机制“艾毒伤元”假说的物质基础的文献及实验研究(BSJJ2012-24)

R 512.91

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.06.012

2016-08-11；

2016-12-12)

1.450046河南省郑州市，河南中医药大学

2.471000河南省洛阳市第一中医院

*通信作者：谢世平，教授；E-mail:xspzz@126.com

*Correspondingauthor:XIEShi-ping,Professor;E-mail:xspzz@126.com