新疆赤霞珠葡萄酒发酵过程中生物胺含量的变化

王 瑞，陈新军，吴新月，张 利，张珍珍*

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.新疆中信国安葡萄酒业有限公司，新疆昌吉830000）

新疆赤霞珠葡萄酒发酵过程中生物胺含量的变化

王 瑞1，陈新军2，吴新月1，张 利1，张珍珍1*

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.新疆中信国安葡萄酒业有限公司，新疆昌吉830000）

利用高效液相色谱技术分析葡萄酒发酵过程中8种生物胺含量的变化。结果表明，葡萄酒发酵过程中8种生物胺总含量整体呈上升趋势。色胺含量最高，最高可达到98.03 mg/L；腐胺和组胺含量较低，含量均不超过2.48 mg/L；精胺和亚精胺含量变化相对平稳，波动范围在1.81～3.07 mg/L之间，除色胺外，其他生物胺含量均不超过4.50 mg/L。苯乙胺、尸胺、酪胺等在酒精发酵后期和苹果酸-乳酸发酵初期大幅上升，在苹-乳发酵后期，酪胺和亚精胺含量有所下降，其他生物胺含量均有一定程度上升。

葡萄酒；生物胺；酒精发酵；苹果酸-乳酸发酵

生物胺是一类具有生理活性的含氮的碱性低分子有机化合物，多存在于动植物体内和食品（尤其是发酵食品）中。适量的生物胺是生物体（包括人体）生理代谢中的正常活性成分，如苯乙胺、儿茶胺等有助于提升人体血压、调节神经活动，亚精胺则能促进生长过程中生物体蛋白质的合成[1]。但当生物胺的摄入量超过一定范围时，则会产生头疼、腹泻和呕吐等一些危害人体健康的不良反应[2]。葡萄酒中的生物胺大多为某些微生物中的氨基酸在其相应的脱羧酶作用下脱羧产生，即不同的脱羧酶催化其对应的氨基酸进行脱羧反应，如苯丙氨酸经脱羧产生苯乙胺，色氨酸脱羧后生成色胺等。这些氨基酸在葡萄酒发酵过程中同时也参与其他化合物的形成与转化[3-4]。

为了降低葡萄酒中生物胺的含量，减少其对人体健康的危害，本研究以赤霞珠葡萄为原料，通过监测在葡萄酒发酵过程中生物胺含量的变化规律，明确关键控制环节，旨在为日后降低葡萄酒中生物胺含量提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤霞珠（Cabernet Sauvignon）葡萄：产自新疆昌吉；甲醇、丙酮（色谱纯）：美国Fisher公司；丹磺酰氯、精胺、亚精胺、组胺、酪胺、尸胺、腐胺、苯乙胺、色胺（色谱纯）：美国Sigma公司；氯化钠、乙醚（分析纯）：南京化学试剂股份有限公司。

1.2 仪器与设备

1200 Series高相液相色谱（high performance liquid chromatograph，HPLC）仪：美国Agilent公司；D2155W离心机：德国Sigma公司；Hc360涡旋仪：美国Merck公司；0.22μm孔径有机相滤膜：上海安谱科学仪器有限公司；DHG-9053A恒温箱：上海鸿都电子科技有限公司；PL303电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；酸度计：上海艾旺工贸有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄酒酿造工艺流程

原料经除梗破碎后，在10L发酵罐中添加酵母0.2g/L、乳酸菌0.015 g/L进行发酵，其中1～27 d为酒精发酵，28～72 d为苹乳发酵，发酵温度控制在22～25℃，分别发酵第1、7、13、20、27、42、57和72天各获取酒样两份，取样量为250 mL。获得新鲜的葡萄酒液后，酒样置于-40℃冰箱。

1.3.2 样品前处理

取葡萄酒10mL，向其中加入NaCl至饱和，用0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值为12，加入5 mL正丁醇∶氯仿（1∶1）进行萃取，漩涡振荡5 min后，吸取上层清液，用同体积萃取液再进行2次萃取，将萃取液合并，摇匀。取3 mL萃取液加人0.3mL的1mol/LHCl溶液，混匀。在40℃水浴条件下用氮气吹干，用1mL（0.1mol/L）盐酸溶液溶解残留物待衍生。

1.3.3 生物胺标准系列溶液的配制

准确称量各生物胺标准品10 mg至10 mL容量瓶中，并用0.1 mol/L盐酸溶液溶解后定容成含量为1 000 mg/L的生物胺标准储备液，封口，避光保存至4℃冰箱中。

分别吸取1 mL各生物胺的标准储备液1 000 mg/L于同一容量瓶（10 mL）中，用0.1 mol/L盐酸溶液定容，混匀成含量为100 mg/L的生物胺标准混合使用液。量取0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.50 mL、5.00 mL生物胺标准混合使用液，分别置于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液定容，使其含量为1.0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、25.0 mg/L、50.0 mg/L的生物胺标准系列溶液，待衍生。

1.3.4 生物胺标准溶液和样品提取液的衍生

吸取0.5 mL上述待衍生的生物胺标准系列溶液，取1.5 mL饱和碳酸氢钠溶液及1 mL丹磺酰氯衍生溶液（0.01 mg/L，溶剂为丙酮）置于10 mL具塞试管中，混匀。60℃避光反应0.5h，加入100μL谷氨酸钠溶液（50mg/mL，溶剂为饱和碳酸氢钠溶液）后振荡混匀，60℃反应15 min后分别加入1 mL的超纯水，40℃的水浴条件下用氮吹仪去除丙酮。加入3 mL乙醚并漩涡振荡2 min，静置至分层后吸取上层有机相，重复萃取两次，合并萃取液。在40℃的条件下氮气吹干，加入1 mL的甲醇溶液溶解残留物，混匀后用0.22 μm有机相滤膜过滤，滤液待HPLC检测。

吸取0.5 mL样品提取液进行衍生，样品提取液的衍生与生物胺标准溶液衍生条件及方法相同。

1.3.5 高效液相色谱条件

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

色谱条件：Agilent XDB-C18色谱柱（150 mm×4.6 nm，5μm），柱温30℃，进样量20μL，紫外检测波长254nm，流动相A：99.99%甲醇溶液，流动相B：超纯水，流速：1.5mL/min，梯度洗脱程序见表1。

1.3.7 定性定量分析

定性分析：在相同色谱条件下，对照8种生物胺标准品HPLC色谱图出峰时间，对样品中各生物胺进行定性分析。

定量分析：通过HPLC色谱检测葡萄酒样品中各生物胺的峰面积，根据8种生物胺标准回归方程，计算葡萄酒样品中各生物胺的含量。

2 结果与分析

2.1 8种生物胺标准回归方程的建立

对8种生物胺混合标准溶液衍生处理后，采用高效液相色谱法进行检测，以峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标，得到8种生物胺标准回归方程，结果见表2。

表2 8种生物胺线性回归方程、相关系数及检出限Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient and limit of detection of eight kinds of biogenic amines

由表2可知，8种生物胺的线性回归方程相关系数R2均＞0.992，说明峰面积与生物胺含量有良好的线性关系，能够满足葡萄酒样品中生物胺含量的检测要求。

2.2 生物胺混合标准品和葡萄酒样品HPLC色谱图

采用高效液相色谱法对8种生物胺混合标品及葡萄酒样品进行检测，结果如图1所示。

由图1A可知，生物胺混合标准品组分在35min内分离效果较好，出峰的时间顺序为：色胺（4.50min）、苯乙胺（14.58 min）、腐胺（17.88 min）、尸胺（20.50 min）、组胺（22.95 min）、酪胺（25.41 min）、亚精胺（27.64 min）、精胺（28.38 min）。由图1B可知，葡萄酒样品中各生物胺出峰顺序为：色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺，出峰时间分别为：4.51 min、14.56 min、17.87 min、20.53 min、22.92 min、25.39 min、27.62 min、28.36 min。

图1 生物胺混合标准品(A)及葡萄酒样品(B)高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of biogenic amines mix standards(A) and wine samples(B)

2.3 葡萄酒发酵过程中生物胺总含量的变化

图2 葡萄酒发酵过程中生物胺总含量的变化Fig.2 Change of biogenic amines content during wine fermentation

葡萄酒发酵过程中8种生物胺总含量的变化见图2，其中1～27 d为葡萄酒酒精发酵时期，此后进入苹乳发酵。由图2可知，在整个发酵过程中，生物胺整体呈上升趋势，尤其是酒精发酵后期和苹乳发酵前期生物胺总含量迅速增加，由最初的8.14mg/L升至46.36mg/L；在苹乳发酵时期，生物胺总含量继续升高，由46.36mg/L升至115.25mg/L，发酵结束进入陈酿阶段后期，含量有所回落。由此可知，葡萄酒中生物胺的产生主要在酒精发酵后期和苹乳发酵初期。在葡萄酒进行苹果酸-乳酸发酵时，葡萄酒中的微生物会优先以苹果酸和可发酵糖为能源物质，而当苹乳发酵过程结束后，因为葡萄酒中缺乏这些可供代谢的发酵底物，则会利用游离的氨基酸作为其能源物质，从而致使葡萄酒中生物胺含量的增加[5-6]。因此，应在这一时期及时进行除菌和抑菌等措施控制葡萄酒中生物胺含量。

2.4 葡萄酒发酵过程中8种生物胺含量的变化

图3 葡萄酒发酵过程中7种生物胺(A)和色胺(B)含量变化曲线Fig.3 Changes of seven kinds of biogenic amines(A)and tryptamine(B)during wine fermentation

葡萄酒发酵过程中8种生物胺含量的变化，结果见图3。由图3可知，在葡萄酒发酵过程中共检测出8种生物胺，分别为色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺。不同发酵时期，8种生物胺的含量有所变化。色胺、组胺、尸胺在发酵开始时未检出，而其他几种生物胺在发酵最初就被检测到，且含量均＜3 mg/L。

在葡萄酒发酵过程中，精胺和亚精胺含量的变化相对平稳，波动范围在1.81～3.07 mg/L，其余6种生物胺都有较大波动。除色胺含量较高（最高可达98.03 mg/L）外，其他7种生物胺含量在发酵过程中均不超过4.50mg/L。酪胺含量在整个发酵过程略高于其他生物胺，葡萄酒中组胺对人类的危害较大，研究显示，口服超过0.008 g的组胺即会产生轻微中毒症状，而当超过0.1 g时则会产生严重中毒症状[7-9]。在葡萄酒发酵的过程中，组胺含量虽然在酒精发酵结束后有明显的上升，但最高含量不超过1.64 mg/L。组胺和腐胺含量最低，苯乙胺、腐胺、尸胺和组胺在酒精发酵后期（20～27 d）时，含量迅速上升，尸胺含量上升最为明显，由0.81 mg/L上升至3.37 mg/L。而随着发酵过程的进行，葡萄酒中各生物胺含量在42～57 d呈下降趋势。在57 d后，除酪胺大幅下降外，其余几种生物胺均有一定程度的上升。

目前，大多数研究认为生物胺的产生主要与氨基酸脱羧酶的活性有关，而与其含量关系较小，且乳酸菌具有氨基酸脱羧酶活性，可使氨基酸转化为生物胺，因此乳酸菌是影响葡萄酒中生物胺含量的主要微生物[13]。此外，酒母也会带入一部分生物胺，这可能会抑制乳酸菌的活性；葡萄醪（汁）中氨基酸的浓度也会在一定程度上影响生物胺的产生量，在一定范围内，浓度越大产生物胺越多[14-16]，而葡萄酒中生物胺的含量与葡萄品种、原料产地、酿造工艺等也有一定关系。

3 结论

本研究采用高效液相色谱法对新疆赤霞珠葡萄酒发酵过程中8种生物胺含量进行了检测。结果表明，在整个发酵过程中，生物胺含量整体呈上升趋势，在酒精发酵后期和苹乳发酵前期生物胺含量迅速增加，总含量由最初的8.14mg/L升高至115.25 mg/L，说明酒精发酵后期和苹乳发酵初期是生物胺生成的主要阶段。葡萄酒中色胺含量最高，最高可达到98.03 mg/L，说明色胺为葡萄酒中主要的生物胺。组胺在整个发酵过程中含量最低，酪胺含量虽是除色胺外含量最高的生物胺，但其含量不超过4.50mg/L。

部分生物胺在苹乳发酵结束时呈上升趋势，因此在苹乳发酵结束后，随着这个时期有杀菌作用的游离SO2的减少，要及时抑菌、除菌，来降低葡萄酒中的生物胺含量。为优化生产工艺，控制发酵条件，从而降低葡萄酒中的生物胺含量提供理论基础。

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Change of biogenic amines content of Xinjiang Cabernet Sauvignon wine in the fermentation process

WANG Rui1,CHEN Xinjun2,WU Xinyue1,ZHANG Li1,ZHANG Zhenzhen1*(1.College of Food Science and Pharmacy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China; 2.Xinjiang CITIC Guoan Wine Industry Co.,Ltd.,Changji 830000,China)

The change of eight biogenic amines content during the wine fermentation were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC).The results showed that the total contents of the eight biogenic amines in wine overall had an ascending tendency.The tryptamine content was the highest of 98.03 mg/L.The contents of putrescine and histamine were lower,not more than 2.48 mg/L.The changes of spermine and spermine contents were relatively stable in the range of 1.81-3.07 mg/L.Except for tryptamine,the contents of other biogenic amines were less than 4.50 mg/L.the contents of phenylethylamine,cadaverine,tyramine and so on increased significantly in the late stage of alcohol fermentation and the preliminary stage of malolactic fermentation.In the late stage of malolactic fermentation,the contents of tyramine and spermidine decreased slightly, and the contents of other biological amines increased to a certain extent.

wine;biogenic amines;alcohol fermentation;malolactic fermentation

N34

0254-5071（2017）01-0131-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.027

2016-07-06

新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2015211A024)；大学生创新创业训练计划项目(201610758082、201610758170)

王瑞(1992-)，女，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。

*通讯作者：张珍珍(1984-)，女，副教授，博士，研究方向为食品质量与安全。