脊柱结核患者TNF-α基因多态性研究

张玉坤，周纲，黄卫民

(新疆医科大学第六附属医院脊柱二科，新疆 乌鲁木齐 830002)

临床研究

脊柱结核患者TNF-α基因多态性研究

张玉坤，周纲，黄卫民*

(新疆医科大学第六附属医院脊柱二科，新疆 乌鲁木齐 830002)

目的 探讨肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)基因启动子区-238A/G、-308A/G位点的基因多态性与脊柱结核的关系。方法 随机抽取新疆医科大学第六附属医院2015年1月至12月收治的脊柱结核患者58例及对照组50例作为研究对象，采取病例-对照方法对两组TNF-α-238 A/G、-308A/G位点的基因多态性进行比较，并使用统计学方法进行分析。结果 病例组与对照组TNF-α-238位点GG、GA基因型频率比较差异有统计学意义，P<0.05；两组-238位点G、A等位基因型频率比较差异无统计学意义，P>0.05；两组TNF-α-308位点GG、GA基因型频率比较差异无统计学意义，P>0.05；两组-308位点G、A等位基因频率比较差异均有统计学意义，P<0.05。结论 TNF-α基因参与了脊柱结核的发生发展过程，且基因多态性和和结核易感性有关，其中-308A等位基因和-238位点GA基因可能参与了脊柱结核的发生。

脊柱结核；TNF-α；基因；等位基因

结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，虽然结核病自20世纪60年代以来已经得到有效控制，但近年来结核病卷土重来，结核杆菌仍然是严重威胁人类健康的病原体之一。骨关节结核是发病率最高的肺外结核，其中脊柱结核是发病率最高的骨关节结核，而且较易导致脊柱畸形，引起残疾[1]。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是巨噬细胞产生的一种细胞因子，可以诱导巨噬细胞抑制体内结核杆菌的生长速度，使机体产生肉芽肿样效应，在对抗结核杆菌中起着重要的保护性防御作用。本研究拟对我院58例脊柱结核患者进行TNF-α基因启动子区-238A/G、-308A/G位点基因多态性的检测，探讨其与脊柱结核易感性是否存在相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机抽取2015年1月至12月在新疆医科大学第六附属医院住院治疗的脊柱结核患者58例作为研究对象，所有患者均经临床表现、影像学检查、病理学检查、病灶结核菌培养及有效的抗结核等综合方式确诊。患者年龄13～61岁，平均(37.21±13.15)岁，其中男性40例，女性18例，维吾尔族33例，汉族25例。同时随机抽取我院健康体检者50例作为对照组，年龄21～60岁，平均(39.25±8.22)岁，其中男33例，女17例，维吾尔族30例，汉族20例。所有研究对象知情同意，排除合并其他感染、恶性肿瘤、艾滋病等疾病的患者。病例组及对照组患者年龄、性别、民族比较差异无统计学意义，P>0.05，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因多态性检验方法 采集患者及体检者空腹外周静脉血2 mL，加入乙二胺四乙酸(EDTA-K2)抗凝的试管。使用改良的碘化钠-氯仿法提取白细胞中DNA，后溶于TE缓冲液，冻存于-20℃冰箱备用。采用特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)设计两套引物，上游引物为5’-GCTAGGAGGGAGAGCAGCAA-3’，下游引物5’-TGAGAGAGGAAGACGGCACA-3’，分别用两个引物进行特异性引物聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增，扩增程序为：94℃预变性5 min后，94℃变性3 min，65℃退火100 s，72℃延伸2 min，反应35个循环，最后72℃延伸为5 min，取7 μL产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳并观察电泳条带以确定分子量的大小。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0中文统计软件包进行数据录入和统计分析，基因型和等位基因频率分布均符合Hard-Weinberg平衡定律，基因型、等位基因频率的比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 TNF-α基因型判定 每份样本PCR反应物均以340 bp的内对照(CYP1A1)基因条带参照，TNF-α-308位点PCR扩增片段201 bp为GG基因型(纯合子)，240 bp为AA基因型(突变纯合子)，201 bp及240 bp条带同时出现为GA基因型(杂合子)；TNF-α-238位点PCR扩增片段178 bp为GG基因型(纯合子)，186 bp为AA基因型(突变纯合子)，178 bp及186 bp条带同时出现为GA基因型(杂合子)，详见图1。

注：Mark为DL-600，分别为100-600 bp的DNA片段；1：TNF-α-308位点GG基因型；2：TNF-α-308位点AA基因型；3：TNF-α-308位点GA基因型；4：空白对照；5：TNF-α-238位点GG基因型；6：TNF-α-238位点AA基因型；7：TNF-α-238位点GA基因型；8：内对照基因；9：空白对照

图1 TNF-α基因电泳鉴定图

2.2 TNF-α基因在脊柱结核患者中的分布 研究结果显示，308位点GG基因占总脊柱结核患者的93.10%，GA占6.90%，等位基因G占96.56%，A占3.52%；238位点的GG基因占93.10%，GA占6.09%，等位基因G占96.56%，A占3.52%。本研究脊柱结核患者中未检出AA型突变纯合子。

2.3 病例组和对照组TNF-α-308、-238位点基因型及等位基因频率比较 本研究中病例组和对照组均未检出AA型突变纯合子。脊柱结核患者和健康体检者TNF-α-308位点G、A等位基因频率比较差异有统计学意义，P<0.05，病例组等位基因A的频率高于对照组；TNF-α-238位点的基因型频率比较差异有统计学意义，P<0.05，病例组GA基因型频率高于对照组，其他无统计学意义，详见表1～2。

表1 病例组和对照组TNF-α-308、-238位点基因型频率比较(例/%)

表2 病例组和对照组TNF-α-308、-238位点等位基因频率比较(例/%)

3 讨 论

脊柱结核同其他部位的结核一样也是以肉芽肿为其典型炎症反应，通常机体抗结核免疫包括细胞免疫和变态反应两种，其中细胞免疫发挥着重要的保护机制，可通过免疫调控杀灭巨噬细胞吞噬的结核杆菌，研究显示[2-3]，包括白细胞介素(interleukin，IL)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、金属蛋白酶(metalloproteinase，MMP)、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)等细胞因子均在结核病变中起着重要的作用。同时，同样背景下的不同种族结核病发病率存在差异，说明基因类型在结核病发生发展的过程中扮演重要的角色[4]。至今发现，人类组织相容性抗原(human leukocyte antigen，HLA)基因、TNF-α基因、核体蛋白sp110、MCP-1-2518[5-6]等基因参与了结核的遗传易感性。

TNF-α是由巨噬细胞激活后产生的一种具有促炎症左右的细胞因子，可以显著诱导巨噬细胞抑制结核杆菌的生长并引起肉芽肿反应[7]。TNF-α可以诱导产生多种细胞因子并间接调节其免疫活性而增加保护功能，对其他细胞因子有趋化和黏附作用，可使其黏附在结核感染部位而促进形成肉芽肿，对防止结核杆菌的扩散起到积极作用[8]。TNF基因主要位于人体的相容性抗原复合体(HLA)Ⅲ类抗原区的一个7kbDNA片段内，由5个小卫星序列与多个单核苷酸多态性启动区构成，具有高度的多态性并共同调节TNF-α的表达。目前TNF-α基因和结核病相关性的研究热点是其-238A/G与-308A/G位点，本研究对58例脊柱结核及50例对照组进行对照研究。结果显示，脊柱结核患者-238及-308位点基因类型均以GG基因为多(约占93.10%)，脊柱结核患者TNF-α-308位点等位基因A的频率高于对照组、G的频率低于对照组；脊柱结核患者TNF-α-238位点GA基因型频率高于对照组、GG基因型频率低于对照组，提示新疆脊柱结核患者TNF-α-308位点A等位基因存在过度表达、TNF-α-238位点GA人群和脊柱结核发病有关。李得春[9]对中国青海地区藏族骨关节结核患者TNF-α-238及TNF-α-308位点的研究显示，藏族人群TNF-α-308A存在过度表达，且TNF-α-238位点多态性可能与藏族骨关节结核发病有关。但Selvaraj、Vejbaesya[10-11]在印度人群及泰国人群的研究中并没有发现TNF-α基因多态性与结核有关。我国林春燕等[12]对我国46例汉族脊柱结核患者TNF-α-238、-308位点基因多态性的研究也未见其相关性。本研究结果也提示新疆地区TNF-α基因多态性和骨关节结核发生有关联，可能与民族有关(本研究样本来源于维汉两个民族)。由于本研究样本量较少，未对维汉患者分开讨论，希望后期扩大样本量对维汉骨关节结核患者TNF-α基因多态性进行比较分析。

以上研究结果提示，TNF-α基因参与了脊柱结核的发生发展过程，其多态性和脊柱结核的易感性可能存在一定关联，表现为TNF-α-308位点A等位基因-238位点GA基因可能参与了脊柱结核的发生。但本研究为小样本量研究，结果是否具有代表性尚需要进一步证实。同时，细胞因子的调节系统是一个非常复杂的体系，细胞因子此消彼长的可能性极大，研究对象体内微小的改变有可能会影响结果的稳定性，故需要多次进行重复试验，以得到最为科学的结论。

[1]赵晓丹，王飞飞，赵鸿飞，等.脊柱结核与化脓性脊柱炎CT鉴别诊断[J].实用放射学杂志，2015，31(4)：621-622.

[2]Patil T，Garg RK，Jain A，et al.Serum and CSF cytokines and matrix metalloproteinases in spinal tuberculosis[J].Inflamm Res，2015，64(2)：97-106.

[3]Chen H，Cheng C，Li M，et al.Expression of TNF-α，IFN-γ，TGF-β，and IL-4 in the spinal tuberculous focus and its impact on the disease[J].Cell Biochem Biophys，2014，70(3)：1759-1764.

[4]Bayley JP，Ottenhoff TH，Verweij CL.Is there a future for TNF promoter polymorphisms[J].Genes Immum，2012，37(5)：315-329.

[5]Guo C，Zhang H，Gao Q，et al.Monocyte chemoattractant protein-1 in spinal tuberculosis：-362G/C genetic variant and protein levels in Chinese patients[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2014，78(1)：49-52.

[6]Gao Q，Du Q，Zhang H，et al.Monocyte chemotactic protein-1 -2518 gene polymorphism and susceptibility to spinal tuberculosis[J].Arch Med Res，2014，45(2)：183-187.

[7]Allie N，Alexopoulou L，Quesniaux VJ，et al.Protective role of membrane tumour necrosis factor in the hosts resistance to mycobacterial infection[J].Immunology，2008，125(4)：522-534.

[8]Rivoisy C，Tubach F，Roy C，et al.Paradoxical anti-TNF-associated TB worsening：Frequency and factors associated with IRIS[J].Joint Bone Spine，2016，83(2)：173-178.

[9]李得春.肿瘤坏死因子仪308和肿瘤坏死因子仅238位点基因多态性与藏族骨关节结核发病关系研究[J].中国全科医学，2015，18(6)：646-647.

[10]Selvaraj P，Sriram U，Mathan KS，et al.Tumour necrosis factor alpha(-238 and -308)and beta gene polymorphisms in pulmonary tuberculosis haplotype analysis with HLA-A，B and DR genes[J].Tuberculosis，2001，81(5/6)：335-341.

[11]Vejbaesya S，Chierakul N，Luangtrakool P，et al.NRAMP1 and TNF-alpha polymorphisms and susceptibility to tuberculosis in Thais[J].Respirology，2007，12(2)：202-206.

[12]林春燕，杨玉芳，方菊飞，等.骨关节结核与TNF-α基因多态性的关系[J].中国脊柱脊髓杂志，2011，21(5)：427-428.

Polymorphismsin Analysis of TNF-α Gene in the Patients with Spine Tuberculosis

Zhang Yukun，Zhou Gang，Huang Weiming

(Spine Department of the Sixth Affiliated Hospital in Xinjiang Medical University，Urumqi 830002，China)

Objective To investigate the association of TNF-α gene polymorphisms at position -238A/G and -308A/G with spine tuberculosis.Methods We randomly selected 58 cases of spinal tuberculosis patients and 50 normal people as control group from January to December in 2015 of Sixth Affiliated Hospital in Xinjiang Medical University.Gene polymorphisms with the -308A/G and-238A/G of TNF alpha were studied.Results There was significant difference in genotype frequencies of region at position -238GG and GA in TNF- α gene between spinal tuberculosis patients and control group，P<0.05.There was no significant difference in allele frequencies of region at position -238G and A between two groups，P>0.05.There was no significant difference in genotype frequencies of region at position -308GG and GA in TNF- α gene between two groups，P>0.05.There was significant difference in allele frequencies of region at position -308G and A between two groups，P<0.05.Conclusion TNF-α genes involved the development process of spinal tuberculosis，and gene polymorphism was susceptibility with TB，-308 A allele and -238 GA gene may be involved with the occurrence of spinal tuberculosis.

spinal tuberculosis；TNF-α；gene；allele

1008-5572(2017)01-0025-03

新疆医科大学创新基金(XJC2013222)；*本文通讯作者：黄卫民

张玉坤，周纲，黄卫民.脊柱结核患者TNF-α基因多态性研究[J].实用骨科杂志，2017，23(1)：25-27.

R529.2

B

2016-05-19