猪源沙门氏菌的耐药性检测与分析

杜雄伟，冮 洁，李 焱，唐文彦，耿亚娟，王佳硕

(大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连 116605)

猪源沙门氏菌的耐药性检测与分析

杜雄伟，冮 洁，李 焱，唐文彦，耿亚娟，王佳硕

(大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连 116605)

采集辽宁省大连市鲜猪肉78份，选择性培养基分离沙门氏菌，划线纯化后，通过invA 序列对菌株进行鉴定，采用纸片琼脂扩散法(K-B法)检测沙门氏菌对12种抗生素的耐药性。结果共得到15株沙门氏菌，检出率为19.23 %。沙门氏菌对各种抗生素的耐药率在0 %～73.3 %，其中对硫酸庆大霉素的耐药率最高，为73.3 %；对其他抗菌药物的耐药率依次是盐酸诺氟沙星(60 %)、氟苯尼考、盐酸环丙沙星(53.3 %)>阿莫西林(13.3 %)>头孢噻吩、头孢噻肟、氨苄西林(6.7 %)>头孢曲松、头孢他啶、氨曲南、亚胺培南(0 %)，共产生10种耐药谱。由此表明，目前大连市开发区的超市和农贸市场受沙门氏菌污染率较高，并且沙门氏菌对各类抗生素表现出了多重耐药谱，应该给予足够的重视。

大连市；猪肉；沙门氏菌；耐药性

在畜禽养殖过程中，抗生素不仅用于控制治疗疾病，还常作为提高动物抗病力，促进生长的饲料添加剂使用[1]，但是有些养殖户大量使用甚至滥用抗菌药物，导致出现耐药菌和沙门氏菌多重耐药现象，其耐药谱也越来越广。因此，通过耐药性试验，掌握沙门氏菌的耐药谱，从而为临床医学治疗中抗生素的合理使用提供科学依据，对食品安全具有重要意义。

孙晓林等[2]对兰州市肉与肉制品微生物污染状况研究结果表明，肉样沙门氏菌检出率为14 %。杨保伟[3]等检测陕西部分地区食品中沙门氏菌污染情况，结果表明沙门氏菌在猪肉中检出率为19.4 %。洪文展等[4]发现深圳市售肉品沙门氏菌污染率为 26.2%。本研究对辽宁省大连市猪源性沙门氏菌进行分离、鉴定及对12种抗生素进行药敏性分析,旨在更好的了解沙门氏菌耐药情况,为确保食品安全提供可信数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

2015年10月至2016年5月期间，采集辽宁省大连市开发区金玛、金发地等超市和大型农贸市场的新鲜猪肉样品68份，从这些样品中共分离15株沙门氏菌。对照菌株为E.coilATCC25922。

1.1.2 培养基及试剂

SS琼脂培养基、水解酪蛋白(mueller-hinton,MH)液、固培养基(北京奥特星生物有限公司)；琼脂糖、Taq DNA 聚合酶、dNTP 及分子质量标准DL2000(大连宝生物公司)；药敏纸片(杭州滨河微生物试剂有限公司)。

1.1.3 药敏纸片

β-内酰胺类：头孢曲松(CRO,30 μg·片-1)，头孢噻吩(KF,30 μg·片-1)，头孢噻肟(CTX，30 μg·片-1)，头孢他啶(CAE，30 μg·片-1)，氨苄西林(AMP，10 μg·片-1)，氨曲南(ATM,35 μg·片-1)，亚胺培南(IPM，10 μg·片-1)，阿莫西林(AMO，10 μg·片-1)。

氯霉素类：氟苯尼考(FLO，30 μg·片-1)。

氨基糖苷类：硫酸庆大霉素(GEN，10 μg·片-1)。

喹诺酮类：盐酸诺氟沙星(NIA，5 μg·片-1)，盐酸环丙沙星(CH，5 μg·片-1)。

以上共有12种药敏纸片。

1.2 方法

1.2.1 采样

每个采集点采集少量新鲜猪肉，无菌封好后放置于保鲜袋内带回实验室，在无菌条件下，按编号用经酒精灯消毒的镊子和手术刀取样少量，剪碎后移入装有营养肉汤的试管内，置于摇床中37 ℃培养18～24 h。

1.2.2 选择性培养与增菌

经过液体培养后的样品前增菌液经过平板划线接种于SS琼脂培养基，置于36±1 ℃下倒置培养18～24 h[5]。根据菌落形态，挑取沙门氏菌可疑菌落。将实验待检测菌株与阳性菌株划线接种于SS斜面培养基，37 ℃恒温培养24 h；再从培养基上用灭菌的接种环挑取一环菌落在营养琼脂平板上进行划线，37 ℃恒温条件培养24 h以分离单菌落。

1.2.3 PCR方法

将纯化的单菌落接种于装有灭菌营养肉汤的1 mL Ep管中，37 ℃恒温培养18～24 h，12 000 r·min-1离心3 min，收集菌体，用移液枪吸取200 μL无菌水于EP管内,清洗2次。清洗后再加入200 μL无菌水。在水浴锅内煮10 min,然后在冰块里冷却5 min,最后在10 000 r·min-1条件下离心5 min。取上清液1 mL 于EP管中。参照文献[6]中的引物序列(由大连宝生物公司合成)，扩增基因为invA基因，扩增片段长度为284 bp。PCR扩增体系25 μL, ExTaq酶(5 U ·μL-1)0.25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，上、下游引物各0.5 uL，dNTPMixture(各2.5 mM)2 μL，模板DNA溶液2.5 μL，ddH2O加至25 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应完成后，进行电泳实验。

1.2.4 药敏试验

采用纸片琼脂扩散法(K-B法)，参考文献[7]所述方法,从平板上挑取单个菌落接种于3 mL MHB，35 ℃培养6～8 h,用生理盐水(0.89 % NaCl)校正浓度至0.5麦氏比浊，用无菌拭子蘸取菌液，涂布MHA平板，平板在室温下干燥5 min，无菌镊子将含药纸片紧贴琼脂表面，35 ℃培养16～18 h,量取抑菌圈直径。大肠埃希氏菌ATCC25922作为质控菌株，参照M100-S20[8]标准判断敏感(S)、中介(I)和耐药(R)，根据药敏实验结果，分析病原菌的耐药谱。

2 结果与讨论

2.1 鲜猪肉样品沙门氏菌PCR检测

从常规PCR电泳图中明显可见约284 bp大小的片段，测序结果与预期大小一致，与GenBank中沙门氏菌invA基因序列同源性为100 %，如图1。

注：M为DL2000 Marker ；1，2，3，5，8，9为阳性菌株扩增产物；4，6，7，10，11为阴性菌株扩增产物

图1 invA基因PCR扩增电泳图

2.2 鲜猪肉样品沙门氏菌的分离鉴定

不同来源样品中沙门氏菌的分离情况见表1。由表1可知，所采集的鲜猪肉样品共分离15株沙门氏菌，可见大连市开发区的超市和农贸市场受沙门氏菌污染率较高，为19.23 %。

表1 不同来源样品中沙门氏菌的分离情况

2.3 猪源沙门氏菌的耐药性

猪源沙门氏菌耐药率见表2。由表2可知，15株沙门氏菌对各种抗生素的耐药率为0 %～73.3 %。其中对GEN的耐药率最高，为73.3 %；对其他抗菌药物的耐药率大小依次是NIA(60 %)>PLO、CH(53.3 %)>AMO(13.3 %)>KF、CTX、AMP(6.7 %)；对KF、CTX、AMP的耐药率均为6.7 %，敏感性达到70 %以上；对CRO、CAE、ATM、IPM的耐药性均为0，敏感性达到90 %以上，这些药物对沙门氏菌都有极强的抗菌作用。从抗生素大类来看，耐药率依次是氨基糖苷类(73.3 %)>喹诺酮类(53.3 %～60 %)>氯霉素类(53.3 %)>β-内酰胺类(0 %～13.3 %)。邹立扣[9]研究表明，猪源沙门氏菌对CRO、CAE的耐药率0 %，与本实验相似。

表2 猪源沙门氏菌耐药率

2.4 猪源沙门氏菌多重耐药谱

本检测分离得到的15株沙门氏菌的耐药性情况见表3。15株沙门氏菌产生了10种耐药谱，15株沙门氏菌中14株具有耐药性，其中11株至少耐受2种抗生素，8株至少耐受3种抗生素。个别菌株可耐受4种以上抗生素。狄文婷[10]等对12株猪源沙门氏菌进行了药敏试验，结果有11株(83.3 %)至少可以耐受1种抗菌药物，其中9株(75 %)至少耐受4种抗生素。马孟根等[11]对30 株猪源致病性沙门氏菌进行了药敏实验，结果有28 株菌(93.3 %)至少对一种药物有耐药性。李郁[12]对合肥市屠宰生猪沙门氏菌耐药性检测发现74.3 %的沙门氏菌对至少一种抗生素产生耐药性，64.7%的菌株为多重耐药。

综上所述，多重耐药猪源沙门氏菌的出现已经成为普遍现象[13-16],应引起足够重视，以降低此类菌感染人类的风险，进而保证人类的健康。

表3 沙门氏菌的耐药谱

3 结 语

本次采集鲜猪肉样品共78份，获得沙门氏菌15株，检出率为19.23 %。研究结果表明，大连地区鲜猪肉污染较为严重，沙门氏菌检出率较高，应对市场流通的鲜肉产品引起足够的重视，加强猪肉屠宰、运输、加工、贮存及销售等环节的管理，防止病原菌污染。

猪源沙门氏菌表现出一定的耐药性，对各种抗生素的耐药率在0 %～73.3 %，其中对GEN、NIA、PLO、CH、AMO耐药率最高，依次是73.3 %、60 %、53.3 %、53.3 %、13.3 %，共产生10种耐药谱。本研究的四大类抗生素中，沙门氏菌对β-内酰胺类具有很高的敏感性，可以得到这些药物对沙门氏菌都有极强的抗菌作用，为临床医学治疗中抗生素的合理使用提供科学依据。

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(责任编辑 邹永红)

Antimicrobial Susceptibility Testing of Salmonella in Fresh Pork

DU Xiong-wei, GANG Jie, LI Yan, TANG Wen-yan,GENG Ya-juan, WANG Jia-shuo

(School of life sciences, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China)

Seventy-eight pork samples were collected in Dalian city Liaoning province.Salmonellawere isolated using selective medium. The isolates were identified by invA sequence analysis. The drug resistance ofSalmonellato 12 kinds of antibiotics was detected by the standard disk diffusion method (K-B). The results show that 15Salmonellawere obtained with detection frequency of 19.23%. The drug resistance rate ofSalmonellato antibiotics was 0 to 73.3%, 73.3% of 15Salmonellaisolates were resistant to GEN. The resistance frequency to other antibiotics decreased in the following order: NIA(60%)>FLO、CH(53.3%)>AMO(13.3%)>KF、CTX、AMP(6.7%)>CRO、CAE、ATM、IPM(0%). There were 10 resistance profiles. City supermarkets and farmers′ markets in Dalian Development Zone is affected by higher rate ofSalmonellacontamination, and theSalmonellashowed multiple resistance to antibiotics. The multi-drug resistant spectrum should be given sufficient attention.

Dalian city；pork；Salmonella；drug resistance

2016-07-11；最后

2016-09-11

“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD38B05)；大连市科技计划项目(2014B11NC094)；大连金州新区科技计划项目(KJCX-ZTPY-2014-0013)；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(DC2015010020401)。

杜雄伟(1978-)，男，山西长治人，讲师，博士，主要从事动物源性食品安全研究。

2096-1383(2017)01-0032-04

S855.3

A