IL-22在类风湿关节炎中的表达及临床意义①

2017-02-15高洪燕周小莉曹春辉

中国免疫学杂志 2017年1期

关键词：滑液外周血细胞因子

邵勤高洪燕周小莉曹春辉

(重庆市中医院风湿病科，重庆400021)

IL-22在类风湿关节炎中的表达及临床意义①

邵勤高洪燕周小莉曹春辉

(重庆市中医院风湿病科，重庆400021)

关节炎，类风湿；白细胞介素22；疾病活动性；骨侵蚀

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的慢性自身免疫病，该病的病因和发病机制尚不明确，目前共识其发生和发展是一个免疫介导事件。CD4+T细胞活化和分化，介导免疫应答，刺激B细胞产生抗体，同时产生细胞因子发生链级反应，活化滑膜、骨、软骨多种组织细胞产生效应分子，引起以组织破坏为主要特征的慢性炎症[1]。但这一免疫事件的启动刺激因子不明确，参与的T细胞及细胞因子形成复杂的网络，相互作用，骨与软骨破坏的确切机制不清楚。辅助性T细胞22(Th22)是新发现的一类CD4+T细胞，其功能主要通过分泌细胞因子IL-22实现。新近报道Th22细胞可能与RA发病相关，但其在RA病理生理中的作用尚不明确[2]。IL-22是RA疾病过程中关键性的细胞因子之一，但其在RA的发病机理中究竟起什么作用存在争议。本研究通过检测RA患者外周血及关节滑液中Th22细胞比例及IL-22水平，探讨Th22/IL-22在RA发病中的作用及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象选取2015年7月至2016年8月我院治疗的RA患者50例，符合1987年ACR或2010年ACR/EULAR对RA的分类标准。其中女性34例，男性16例，年龄20～78岁，平均(51±18)岁，病程2月～39年，平均(8±6)年。DAS28评分1.84～7.30，平均(4.41±2.10)分。随机选取年龄和性别相匹配的骨关节炎患者15例和体检中心健康者15例作为对照组。OA组及健康对照组与RA组在性别、年龄构成等方面差异无统计学意义。根据RF检测将RA患者分为RF阳性RA(40例)和RF阴性RA(10例)。根据抗CCP抗体检测将RA患者分为抗CCP阳性RA(38例)和抗CCP阴性RA(12例)。RA患者根据关节X线检查改变分为四期。50例RA患者中12例有关节积液者抽取关节滑液并分析。本研究通过本院伦理委员会批准，并获得入选对象知情同意，签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂及仪器 FITC 标记的人CD4 抗体，PerCD标记的人IL-22抗体，APC标记的人IL-17抗体，PE标记的人IFN-γ抗体及相应抗体同型对照购自eBioscience公司；佛波酯(PMA)、离子霉素(Ionomycin)、布雷非德菌素A(BFA)、FIX&PERM Kit试剂盒购自MultiSciences公司；Ficoll人淋巴细胞分离液购自TBDscience公司；SepMateTM离心管购自STEMCELL Technologies公司；RPMI1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自江苏MRC公司；人IL-22 ELISA Kit购自PeproTech公司。流式细胞仪为美国BD Accuri C6型；酶标仪为美国伯腾公司Synergy HTX型。

1.2 方法

1.2.1 流式细胞仪检测外周血及关节滑液Th22 所有受试者抽取清晨空腹静脉血5 ml，1×PBS稀释后加入SepMateTM离心管的Ficoll人淋巴细胞分离液中，3 000 r/min离心30 mim，分离获得PBMCs。RPMI1640培养基重悬PBMCs，细胞悬液加入PMA(50 ng/ml)、离子霉素(1 μg/ml)、BFA(2 μg/ml)，37℃ 5%CO2培养箱培养4 h。收集细胞，加入5 μl FITC标记的抗人CD4，对照管加入5 μl同型对照抗体，震荡混合均匀，室温避光染色15 min。加入Medium A 100 μl固定细胞，混匀避光孵育15 min。PBS洗涤后加入100 μl Medium B和5 μl PerCP标记的抗人IL-22抗体，5 μl APC标记的人IL-17抗体，2 μl PE标记的人IFN-γ抗体，相应同型对照抗体加至同型对照管，避光孵育20 min。PBS洗涤后制成细胞悬液，转移至流式管，上机检测。12例RA患者抽取关节滑液10 ml，同以上步骤检测Th22细胞比例。

1.2.2 ELISA检测血清及关节滑液IL-22 入选对象抽取静脉血离心后收集血清，12例关节腔积液的RA患者抽取关节滑液10 ml，离心收集上清液，按照试剂盒要求步骤用ELISA法检测IL-22浓度。

1.2.3 收集整理RA患者临床资料及检查指标记录RA患者性别、年龄、病程、肿胀及压痛关节数、疼痛评分、关节外症状，检测ESR、CRP、RF、抗CCP抗体等实验室指标，计算DAS28评分。根据X线改变分为四期：Ⅰ期无骨质破坏，可见骨质疏松；Ⅱ期显示骨质疏松，可有轻度软骨破坏或软骨下骨质破坏，无关节畸形；Ⅲ期骨质疏松伴软骨或骨破坏，有关节畸形，无纤维性或骨性强直；Ⅳ期纤维性或骨性强直。

2 结果

2.1 Th22细胞比例和IL-22水平在各组外周血的表达 RA患者外周血Th22细胞比例高于OA组(t=2.290，P=0.021)及健康对照组(t=2.524，P=0.015)，差异有统计学意义。RA患者血清IL-22水平高于OA组(t=2.560，P=0.014)及健康对照组(t=2.768，P=0.009)，差异有统计学意义。见表1。

表1 各组外周血Th22细胞比例及IL-22表达水平比较

Tab.1 Proportion of Th22 and level of IL-22 in peripheral blood in different groups

GroupsnTh22(%)IL⁃22(ng/L)RApatients50198±0711)2)53746±83271)2)OApatients15121±05237918±5687Healthycontrol15118±04534638±5231

Note：1)P<0.05 vs OA patients;2)P<0.05 vs healthy controls.

表2 RA组血清IL-22水平与RF、抗CCP抗体、关节积液的相关性

Tab.2 Correlation between level of IL-22 and RF,anti-CCP,SF in RA patients

RF(+)(-)anti⁃CCP(+)(-)SF(+)(-)n401038121238IL⁃2(ng/L)54875±842639748±421656078±959038638±685260025±765341256±5780t232225042587P003500150012

表3 RA组血清IL-22及实验室指标相关性分析

Tab.3 Correlation analysis of IL-22 and laboratory indexes in RA patients

ESRCRPRFDAS28r0312016303140332P0036024200320021

表4 IL-22及Th22在RA外周血及关节滑液中的表达

Tab.4 Expression of IL-22 and Th22 in peripheral blood and SF of RA patients

Th22(%)IL⁃22(ng/L)Peripheralblood198±07153746±8327Synovialfluid167±05172579±8645t11982668P02850011

2.2 RA患者血清IL-22与RF、抗CCP抗体的关系 RF阳性RA血清IL-22水平高于RF阴性RA(t=2.322，P=0.035)。抗CCP抗体阳性RA血清IL-22水平高于抗CCP抗体阴性RA(t=2.504，P=0.015)。见表2。

2.3 RA血清IL-22与炎性指标及疾病活动度的关系 RA血清IL-22水平与ESR、RF、DAS28评分呈正相关关系(P<0.05)，与CRP无明显相关性(P>0.05)。见表3。

2.5 有关节积液RA患者IL-22及Th22细胞的表达有关节积液RA患者(12例)血清IL-22水平高于无关节积液RA患者(38例)(t=2.587，P=0.012)，差异有统计学意义。见表2。关节滑液与外周血中Th22细胞比例无统计学差异(t=1.198，P=0.285)。关节滑液IL-22水平高于血清(t=2.668，P=0.011)，与关节滑液Th22细胞比例无相关性(r=0.287，P=0.065)。见表4。

3 讨论

IL-22是2000年Renauld小组首次发现的新型细胞因子。IL-22属IL-10细胞因子家族成员，由多种免疫细胞Th1、Th22、Th17等产生。IL-22受体复合物是IL-10R2和IL-22R1构成的异源双链二聚体， IL-22R1与IL-22亲和力低，决定了与IL-22结合的特异性。IL-22与IL-22R结合后，诱导细胞内一些信号转导级联途径活化，包括JAK/STAT信号通路和MAPK/ERK信号通路(MKKS→ERK1/2、JNK/SAPK、p38)，引起特定基因表达，从而参与细胞增生、分化、迁移和凋亡[3]。IL-22是Th22细胞的主要效应因子，目前有关Th22细胞生物学功能研究主要基于对IL-22的认识。新近报道有研究者提出Th22细胞参与RA发病，IL-22可作为RA治疗靶点[4]。

几项人体实验研究发现，活动性RA患者外周血IL-22水平显著高于健康对照人群[5]。本研究亦证实RA患者外周血中Th22细胞比例及IL-22水平增高，高于OA患者及健康对照组，从细胞因子表达水平来分析，IL-22与RA有相关性。目前认为IL-22是RA疾病过程中关键性细胞因子之一，但其在RA的发病机理中究竟起什么作用存在争议。大多数学者认为IL-22是一种促炎因子。动物实验中发现C57BL/6小鼠胶原诱导性关节炎(Collagen induced arthritis,CIA)模型血清及滑膜组织中检测到高水平的IL-22和IL-22R1；较之野生型小鼠，IL-22基因敲除小鼠CIA发生率低、关节损伤程度轻、血管翳形成少，据此推测IL-22参与CIA致病过程[6,7]。在抗原诱导小鼠关节炎(AIA)发病起始阶段，IL-22通过激发IL-1Β产生促炎作用。抗IL-22抗体和IL-22基因敲除可使小鼠关节炎症反应减轻[8]。但也有报道在关节炎的发病过程中，IL-22/IL-22R表达增加。CIA体外实验中，IL-22同时诱导促炎因子和抗炎因子产生。IL-22对早期关节炎有保护作用，机制与增加IL-10水平有关。提示IL-22在炎性关节炎中具有保护及致病双重作用，取决于疾病发展的不同阶段[9]。

临床上RA的早期诊断及准确的疾病活动度评估对该病的诊疗及预后均有重大意义。目前临床上评价RA疾病活动度需要综合诸多因素来判断，如DAS28评分、晨僵时间、疼痛及CRP、ESR、RF等，但存在相关指标测定复杂、影响因素多等缺点。近年来，炎症指标的客观评价受到重视，如找到更加敏感和特异的炎症指标则能更好地服务临床。RF与抗CCP抗体作为RA特征性自身抗体，对RA的早期诊断有非常重要的意义，而且与病情活动及预后均有关。血清持续高滴度RF是RA关节破坏及预后不良的因素，抗CCP抗体与RA病情严重程度及治疗效果差异相关[10]。本研究发现RA外周血IL-22水平与RF及抗CCP抗体有一定相关性，体现在RF阳性RA患者IL-22水平高于RF阴性RA，抗CCP抗体阳性RA患者IL-22水平高于抗CCP抗体阴性RA。而且IL-22水平与DAS28评分、RF、ESR实验室指标呈正相关，提示IL-22水平与疾病活动性呈正相关，在一定程度上反映了疾病活动度高低。相似的临床实验观察及结果亦见报道[11,12]。由此推断IL-22有可能成为RA疾病活动性评估的新的炎症指标，对疾病早期诊断、病情评估及预后判断均有帮助。

RA以滑膜炎及骨关节软骨侵蚀为主要特征，骨关节的破坏畸形及功能丧失是RA最为严重的不良预后。细胞因子在T细胞活化、迁移致使关节损伤中起关键作用。成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocyte,FLS)通过产生细胞因子、趋化因子和MMP-1等促进滑膜炎症持续性和慢性化并导致骨质破坏，在RA滑膜炎的发病机制中发挥关键作用。FLS高表达IL-22和IL-22R1，活化FLS呈时间和剂量依赖性产生IL-6，介导炎症反应[13]。体外实验中发现IL-22促进破骨细胞增殖，提示IL-22与骨质破坏相关。Leipe等[14]检测早期RA患者血清IL-22水平，并追踪观察2年，监测临床症状及影像学改变，经多元回归分析表明IL-22升高是RA骨侵蚀的独立、有显著意义的相关因素。Kim等[15]研究发现IL-22能上调RA患者RASF中RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)的表达，进而激活p38、MAPK/NF-κB与JAK-2/STAT-3信号来促进破骨细胞形成。IL-22抗体可减轻关节炎症及骨质破坏[16]。本研究发现RA血清IL-22与关节骨破坏X线分期有相关性，即关节破坏越严重，IL-22血清水平越高，表明IL-22参与介导RA骨质破坏进程。其临床意义在于血清高IL-22水平对于骨质破坏有预警作用，IL-22可能成为预测骨破坏的指标。

关节积液为急性或亚急性关节渗出性炎症所致，常出现在RA患者炎症活动期，表现为关节的肿胀压痛及活动受限。关节积液的发生多提示RA疾病活动度高。本研究发现有关节积液的RA患者血清及关节滑液IL-22水平较无关节积液者高，从另一方面验证了IL-22水平与疾病活动性相关，可作为RA疾病活动性评估的炎症指标，这与上述的IL-22与ESR、RF、DAS28评分及疾病活动度的正相关性结论是一致的。本研究同时发现关节滑液IL-22水平高于血清，且与关节滑液Th22细胞比例无相关性。这一结果提示关节滑膜作为RA主要和特征性的病变部位，亦是免疫反应的主要场所，局部的免疫细胞和细胞因子高浓度聚集。已有相关报道RA滑液IL-22水平高于OA[17]。同时也说明了免疫反应的复杂性。Th22细胞分泌的IL-22占体内IL-22总量的65%。IL-22水平与Th22细胞呈正相关。但IL-22除Th22细胞外，还可由多种免疫细胞(Th1、Th17、NK、γδT)和淋巴结组织诱导细胞(Lymphoid tissue inducer，LTi)、LTi样细胞产生[18]。Th17细胞除分泌IL-22外，更主要的是分泌IL-17、IL-21。Th17细胞及其分泌的细胞因子在RA中的作用已有较多报道[19]。IL-22参与Th17细胞的效应功能，IL-22与IL-17协同作用，可以增强炎症反应并造成组织损伤，IL-17与IL-22共同表达被认为是自身攻击性T细胞和促炎T细胞的标志。相关文献研究证实NK-22细胞分泌的高浓度IL-22参与RA发生和发展过程。RA患者关节囊滑液和外周血NK-22细胞比例均明显升高，分泌高浓度IL-22促进RA滑膜成纤维细胞增殖[20]。由此推断，RA关节滑液中高浓度的IL-22由多种活化的免疫细胞产生，它们共同参与免疫反应，构成复杂的网络系统发挥作用。

综上所述，Th22细胞与IL-22参与RA发病机制，阻断IL-22/IL-22R作用环节是RA可能的免疫靶向治疗途径。鉴于IL-22与疾病活动性的相关性，IL-22水平有可能成为RA疾病活动度评估的新指标。同样道理，由于IL-22在RA影像学进展中起作用，可成为RA骨侵蚀的血清学标志。这可能是IL-22在下阶段最为实际的临床诊断方面的意义。

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[收稿2016-09-07]

(编辑倪鹏)

Expression and clinical significance of interleukin-22 in patients with rheumatoid arthritis

SHAOQin,GAOHong-Yan,ZHOUXiao-Li,CAOChun-Hui.

DepartmentofRheumatology,ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400021,China