TLR2/4在MTB Hsp16.3刺激小鼠巨噬细胞过程中表达及作用的初步探讨①

李姗姗 秦 欢 刘芊伊 徐 林 张继东 冯继红 李龙梅 泮红飞 罗军敏

(遵义医学院免疫学教研室，贵州省免疫分子应用研究工程中心，遵义563099)

TLR2/4在MTB Hsp16.3刺激小鼠巨噬细胞过程中表达及作用的初步探讨①

李姗姗 秦 欢 刘芊伊 徐 林 张继东 冯继红 李龙梅 泮红飞 罗军敏

(遵义医学院免疫学教研室，贵州省免疫分子应用研究工程中心，遵义563099)

目的：在体外细胞水平，初步探讨TLR2/4在MTB Hsp16.3刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞的表达及作用。方法：从BALB/c小鼠的胫腓骨中取骨髓细胞，与GM-CSF共培养获得骨髓来源的M0型巨噬细胞，流式检测F4/80和CD11b的表达并观察其形态；100 ng/ml MTB Hsp16.3刺激M0巨噬细胞，分别培养0、12、24、36、48、72 h，Real-time PCR检测不同时间点TLR2/4的表达水平；利用RNAi干扰技术沉默巨噬细胞表面的TLR2/4受体，MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的M0巨噬细胞，分别培养0、12、24、36、48、72 h，Real-time PCR检测不同时间点TLR2/4及Ym-1、Fizz1、IL-10 、TNF-α、iNOS、TGF-β细胞因子的表达水平。结果：M0型巨噬细胞在MTB Hsp16.3刺激后出现了较短的伪足，沉默TLR2/4 的M0型巨噬细胞在MTB Hsp16.3刺激后出现了较长伪足；M0巨噬细胞在MTB Hsp16.3刺激后高表达TLR2/4。MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4 的M0型巨噬细胞，高表达M1型巨噬细胞相关的细胞因子IL-6、TNF-α、iNOS，低表达M2型巨噬细胞相关的细胞因子IL-10、TGF-β、Ym-1、Fizz1。结论：MTB Hsp16.3 通过TLR2/4促进M0型巨噬细胞向M2型转化，抑制M1型巨噬细胞，这可能参与了MTB躲避巨噬细胞的吞噬过程。

结核分枝杆菌；Toll样受体；MTB Hsp16.3；替代性活化巨噬细胞

结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的慢性传染性疾病。MTB是典型的胞内菌，主要寄居于巨噬细胞内与宿主免疫系统相互斗争[1]。当机体感染MTB后，巨噬细胞可发挥免疫调节作用，抑制或杀灭MTB[2]。同时MTB可以通过多种机制来逃逸巨噬细胞的杀伤，如抑制巨噬细胞的凋亡，逃避巨噬细胞的吞噬及避免反应氧和反应氮产物的毒性等[3]。在多种机制的研究中，MTB逃避巨噬细胞的吞噬受到了较为广泛的关注。Lopes等[4]研究发现，Dnak蛋白可以诱导巨噬细胞向低吞噬功能的M2型转化，使得MTB可以逃避巨噬细胞的吞噬。本实验室前期研究发现，MTB Hsp16.3可以刺激巨噬细胞向M2型转化[5]，然而其机制是尚不清楚，为此探讨MTB Hsp16.3刺激巨噬细胞向M2型转化的机制将有助于后续研究MTB逃避巨噬细胞吞噬的机制。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是介导天然免疫和获得性免疫的主要受体[6]，可以通过MTB的一些成分介导细胞活化，启动天然免疫系统的吞噬和杀菌的效应机制。在TLR家族中,TLR2/4是巨噬细胞识别和杀伤结核分枝杆菌的重要受体[7]。在前期研究的基础上，本实验拟观察巨噬细胞在MTB Hsp16.3诱导后TLR2/4的动态变化水平，观察MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的M0型巨噬细胞相关细胞因子的动态表达情况，从TLR2/4信号通路探讨MTB Hsp16.3刺激巨噬细胞向M2型转化的作用机制，为深入探讨MTB逃避巨噬细胞的吞噬作用的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 MTB Hsp16.3蛋白由本实验室制备保存。BALB/c小鼠购自重庆医科大学实验动物中心；PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real-time、SYBR Premix Ex Taq 、Lipofectamine 2000购自TaKaRa公司；Real-time PCR引物合成由Invitrogen公司完成；siRNA有广州锐博公司设计合成。

1.2 方法

1.2.1 收集和鉴定小鼠骨髓来源的巨噬细胞 将6～8周雌性BALB/c小鼠脱臼处死，无菌取小鼠胫骨和股骨骨髓细胞，经红细胞裂解液裂解，10% FBS的DMEM培养液洗涤后，1 000 r/min，10 min离心后加入10% FBS的DMEM培养液调整细胞密度至1×106ml-1，培养第7天后去除非贴壁细胞，再用10% FBS的DMEM培养液培养；第8天收集贴壁细胞即为骨髓来源巨噬细胞，并在光镜下观察巨噬细胞的形态，收集细胞。

1.2.2 siRNA转染 由广州锐博公司设计合成3对siRNA序列。待骨髓来源的巨噬细胞比率达到或大于80%，可进行脂质体转染。每孔加入2 ml含10% FBS的DMEM培养液，1 μl Lipofectamine 2000 与 20 pmol siRNA转染混合物，37℃、5%CO2条件下转染48 h，设为转染组。

1.2.3 MTB Hsp16.3蛋白刺激巨噬细胞 100 ng/ml MTB Hsp16.3[7]分别刺激M0巨噬细胞和转染组的巨噬细胞，每组3个复孔，并设空白对照组。置于5%CO2的37℃恒温培养箱中培养0、12、24、36、48、72 h，培养后分别收集细胞及上清。

1.2.4 细胞总RNA抽提和逆转录 取上述3组培养后的细胞，TRIzol法抽提总RNA(按试剂盒说明书进行)，采用紫外分光光度仪测定所提RNA的浓度和纯度。以总RNA为模板，Oligo(dt)为引物，mRNA反转录为cDNA进行后续检测。

1.2.5 qRT-PCR检测相关因子mRNA的相对表达量 以反转录的cDNA为模板进行qRT-PCR(按照SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒说明书进行)，反应体系：ddH2O 8 μl，SYBR 10 μl，cDNA 1 μl，上、下游引物(见表1)各0.5 μl，总体积20 μl。反应参数：95℃预变性30 s；95℃变性5 s；60℃ 30 s，45个循环。Real-time PCR实验数据用2-ΔΔCt法(Ct为荧光达到阈值时所需PCR的循环数)分析样本TLR2、TLR4、Ym-1、Fizz1、IL-10、TGF-β、iNOS、IL-6、TNF-α mRNA的相对表达量。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

GeneUpstream(5′⁃3′)Downstream(5′⁃3′)GAPDHGAGCCAAACGGGTCATCATCTGAGGGGCCATCCACAGTCTTTLR2TGGTGTCTGGAGTCTGCTGTGCGCTCCGTACGAAGTTCTCAGTLR4CCTGACACCAGGAAGCTTGAACTTCAAGGGGTTGAAGCTCAGYm⁃1GCAGAAGCTCTCCAGAAGCAATCCTGATTGGCCTGTCCTTAGCCCAACTGFizz1GCTGATGGTCCCAGTGAATACCCAGTAGCAGTCATCCCAGCIL⁃10TACAGCCGGGAAGACAATAAAGGAGTCGGTTAGCAGTATGTGF⁃βGGCGGTGCTCGCTTTGTATCCCGAATGTCTGACGTATTGAiNOSCTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTGGGAGTAGCCTGTGTGCACCTGGAAIL⁃6GAGGATACCACTCCCAACAGACCAAGTGCATCATCGTTGTTCATACATNF⁃αCAGGGGCCACCACGCTCTTCTTTGTGAGTGTGAGGGTCTGG

1.2.6 ELISA检测转染后巨噬细胞相关细胞因子表达水平 取上述培养后收集好的细胞培养上清，用ELISA检测TNF-α、IL-10、TGF-β细胞因子的分泌。按照试剂盒说明加样，置于37℃温育60 min，加洗涤液洗板5次，加显色剂A、B，37℃避光显色5～15 min后加入终止液，终止反应。450nm波长检测吸光度(OD)值并测各细胞因子浓度。

2 结果

2.1 MTB Hsp16.3刺激巨噬细胞后TLR2/4的变化

2.1.1 巨噬细胞的形态 光镜下观察M0型巨噬细胞呈圆形(图1A)，MTB Hsp16.3刺激后巨噬细胞出现了较短的伪足(图1B)，MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的巨噬细胞出现了较长的伪足(图1C)。

2.1.2 MTB Hsp16.3刺激巨噬细胞后TLR2/4 mRNA表达水平 在体外培养条件下，100 ng/ml MTB Hsp16.3刺激M0型巨噬细胞，取贴壁细胞进行Real-time PCR，检测不同时间点TLR2/4 mRNA的相对表达水平。所有扩增曲线均无非特异性荧光，溶解曲线呈单峰，产物特异性好。结果显示，MTB Hsp16.3刺激后的巨噬细胞TLR2/4 mRNA (图2) 的相对表达量较对照组显著增加(P<0.05)。

2.2 MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的巨噬细胞后的变化

2.2.1 TLR2/4 siRNA的沉默效率 转染24 h后，取各组贴壁细胞进行Real-time PCR，检测TLR2/4 mRNA表达水平，结果显示：与阴性对照组比较，siRNA各组的TLR2/4 mRNA表达水平均明显降低(图3)，在后续的实验中分别用了TLR2的siRNA-3，TLR4的siRNA-1序列进行实验。

图1 电镜下巨噬细胞形态(×20)Fig.1 Morphology of macrophages by light microsco-pe(×20)Note: A.M0 macrophages；B.Macrophages after MTB Hsp16.3 stimulated;C.si-TLR2/4 macrophages effected with MTB Hsp16.3.

2.2.2 MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的巨噬细胞后相关细胞因子mRNA表达水平 在体外培养条件下，100 ng/ml MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4后的巨噬细胞，分别刺激0、12、24、36、48、72 h后取贴壁细胞进行Real-time PCR，检测不同时间点细胞因子mRNA的相对表达水平。所有扩增曲线均无非特异性荧光，溶解曲线呈单峰，产物特异性好。结果显示：MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2的巨噬细胞后Ym-1、Fizz和IL-10 mRNA(图4A)的相对表达量较MTB Hsp16.3刺激组显著下降(P<0.05)，iNOS、IL-6和TNF-α mRNA的相对表达量较MTB Hsp16.3 刺激组显著上调(P<0.05)； MTB Hsp16.3刺激沉默TLR4的巨噬细胞后Fizz1、TGF-β和IL-10 mRNA(图4B)的相对表达量较MTB Hsp16.3刺激组显著下降(P<0.05)，iNOS、IL-6和TNF-α mRNA的相对表达量较MTB Hsp16.3刺激组显著上调(P<0.05)。

图2 MTB Hsp16.3刺激巨噬细胞后TLR2/4 mRNA表达水平Fig.2 Expression level of TLR2/4 mRNA after MTB Hsp16.3 stimulated macrophagesNote: A.TLR2；B.TLR4；*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

图3 TLR2/4 siRNA的沉默效率Fig.3 Silencing efficiency of TLR2/4 siRNANote: A.TLR2；B.TLR4；**.P<0.01；***.P<0.001.

图4 MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的巨噬细胞相关细胞因子的表达水平Fig.4 Expression levels of cytokine mRNA in TLR2/4 silencing macrophages after MTB Hsp16.3 stimulatedNote: A.TLR2;B.TLR4;*.P<0.05;**.P<0.01.

图5 MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的巨噬细胞各细胞因子的分泌水平Fig.5 Secretion levels of cytokine mRNA in siRNA silencing macrophages after MTB Hsp16.3 stimulatedNote: **.P<0.01.

2.2.3 细胞培养上清进行ELISA检测 结果显示：MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的巨噬细胞，TGF-β和IL-10水平显著降低(P<0.05)，TNF-α水平明显增加(P<0.05，图5)，上述各细胞因子ELISA结果与qRT-PCR结果一致。

3 讨论

MTB入侵宿主后主要在巨噬细胞内寄居，一方面巨噬细胞可以抑制或杀灭MTB，另一方面MTB可以通过逃避巨噬细胞的吞噬，抑制巨噬细胞的凋亡等机制躲避巨噬细胞的杀伤。研究发现，MTB在逃避巨噬细胞吞噬的过程中，可以抑制吞噬小体与溶酶体融合，抑制吞噬小体的酸化以及诱导巨噬细胞转化为低吞噬功能的M2型巨噬细胞等[8]。其中，诱导巨噬细胞转化为低吞噬功能的M2型巨噬细胞受到了关注。本实验室前期发现了MTB Hsp16.3与巨噬细胞有着一定的联系[9]。MTB Hsp16.3是由hspX 基因编码的，存在于MTB膜上的主要抗原蛋白，在MTB休眠阶段大量表达[10]。研究发现MTB Hsp16.3可以抑制巨噬细胞自噬体的形成[11]，抑制小鼠肺泡巨噬细胞的凋亡[12]，从而使得MTB在巨噬细胞内存活。前期实验研究发现，MTB Hsp16.3可以刺激巨噬细胞向低吞噬的M2型转化，为深入探讨MTB逃避巨噬细胞的吞噬作用的机制奠定基础。

Toll样受体是一种重要的模式识别受体，是宿主天然免疫系统的关键成分。MTB的某些成分可以介导细胞活化，启动天然免疫系统的吞噬和杀菌的效应机制。研究发现，在小鼠慢性结核病的模型中，TLR4低表达的小鼠可转变为慢性肺炎，且肝、脾、肾等器官可见MTB的扩散[13]；Lacavé等[14]发现鞭毛蛋白可以通过TLR5诱导巨噬细胞向M2型极化。提示Toll受体与MTB、M2型巨噬细胞有着一定的关系。为此，本研究将从TLR2/4信号通路探讨MTB Hsp16.3刺激巨噬细胞向M2型转化的作用机制。

实验结果显示：MTB Hsp16.3刺激M0型巨噬细胞后，镜下观察巨噬细胞出现了较短的伪足，整体形态较为收拢，而沉默TLR2/4后巨噬细胞出现了较长的伪足；Real-time PCR检测MTB Hsp16.3刺激M0型巨噬细胞后TLR2/4表达情况，显示刺激后巨噬细胞高表达TLR2/4；Real-time PCR检测沉默TLR2/4的巨噬细胞在MTB Hsp16.3刺激后，相关细胞因子的表达情况，显示沉默TLR2后，M0型巨噬细胞高表达iNOS、IL-6和TNF-α，低表达M2相关细胞因子Ym-1、Fizz1和IL-10；沉默TLR4后，iNOS、IL-6和TNF-α表达水平显著上调Fizz1、TGF-β和IL-10的表达水平显著下降。ELISA结果与real time PCR结果一致。

上述研究发现，在MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的巨噬细胞后，M2型巨噬细胞相关细胞因子呈现低表达状态，提示在MTB Hsp16.3刺激巨噬细胞向M2转化的过程中，TLR2/4起到一定的作用。为此我们猜测MTB Hsp16.3可能通过与巨噬细胞膜上TLR2/4结合，激活相关的信号通路，从而使得巨噬细胞向M2型转化，分泌相关的细胞因子。本实验仅在体外细胞水平初步探讨了TLR2/4在MTB Hsp16.3刺激小鼠巨噬细胞过程中表达及作用，然而具体的信号途径及在体内感染MTB模型中，MTB Hsp16.3诱导巨噬细胞向M2转化的过程是通过MTB Hsp16.3直接释放到胞外或者其他方式与巨噬细胞的TLR2/4结合都需要进行后续的深入探讨。本研究将有助于阐明MTB逃避巨噬细胞的吞噬作用的机制，为结核病免疫防治提供合适的候选分子靶点。

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[收稿2016-06-06 修回2016-08-22]

(编辑 倪 鹏)

Study of expression and regulation of TLR2/4 in mycobacterium tuberculosis heat shock proteins 16.3 effect on mouse bone marrow-derived macrophages

LIShan-Shan，QINHuan，LIUQian-Yi，XULin，ZHANGJi-Dong，FENGJi-Hong，LILong-Mei，PANHong-Fei，LUOJun-Min.

DepartmentofImmunology，ZunyiMedicalCollege，ImmuneMoleculesApplicationResearchCenterinGuizhouProvince，Zunyi563099，China

Objective:To study the expression and regulation of TLR2/4 in mycobacterium tuberculosis heat shock proteins 16.3 (mycobacterium tuberculosis heat shock proteins 16.3,MTB Hsp16.3) effect on mouse bone marrow-derived macrophages in vitro.Methods: Bone marrow cells were isolated from tibia and femurs of BALB/c mice and incubated with GM-CSF，then detected the expression of CD11b and F4/80 with flow cytometry and observed morphology.The M0 macrophages were stimulated with MTB Hsp16.3 for 0 h,12 h,24 h,36 h,48 h and 72 h.Real-time PCR detected the expression of TLR2/4 in intracellular at different time point.Silencing macrophages cell surface TLR2/4 molecules by siRNA technology which stimulated with MTB Hsp16.3 for 0 h,12 h,24 h,36 h,48 h and 72 h.Real-time PCR detected the expression of TLR2/4,Ym-1,Fizz1,IL-10,TNF-α,iNOS and TGF-β in intracellular at different time point.Results: Morphology analysis showed that MTB Hsp16.3 stimulated macrophages were round cells stretching out pseudopodia,whereas MTB Hsp16.3 stimulated silencing TLR2/4 macrophages had elongated fibroblastoid.Real time PCR detected the expression of TLR2/4 were upregulated after MTB Hsp16.3 stimulated M0 macrophages.MTB Hsp16.3 stimulated silencing TLR2/4 macrophages the expression of IL-6,TNF-α,iNOS were upregulated,whereas IL-10,TGF-β,Ym-1 and Fizz1 were downregulated.Conclusion: MTB Hsp16.3 may stimulated M0 macrophages to M2 macrophages and suppress M1 macrophages through binding with TLR2/4 receptor,which may be involved the progresss of MTB evaded macrophage phagocytosis.

Mycobacterium tuberculosis;Toll like receptors;Mycobacterium tuberculosis heat shock proteins 16.3;Alternatively activated macrophage

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.007

①本文受国家自然科学基金地区项目(81460249)资助。

李姗姗(1990年-)，女，在读硕士，主要从事感染免疫学方面的研究，E-mail:lss2958@126.com。

及指导教师：罗军敏(1970年-)，女，硕士，教授，硕士生导师，主要从事感染免疫学方面的研究，E-mail: luojm128@163.com。

R392.11

A

1000-484X(2017)01-0036-05