IL-1β促进肺癌细胞增殖的作用机制研究①

石玉荣 吴军录 权文强 李 冬

(蚌埠医学院生物化学与分子生物学教研室，蚌埠233000)

IL-1β促进肺癌细胞增殖的作用机制研究①

石玉荣 吴军录②权文强③李 冬②③

(蚌埠医学院生物化学与分子生物学教研室，蚌埠233000)

目的：研究IL-1β在巨噬细胞促进肺癌细胞增殖的作用机制。方法：采用Transwell®插入式细胞培养皿共培养人肺癌细胞株A549、NCI-H520细胞和巨噬细胞。BrdU-ELISA法检测巨噬细胞对肺癌细胞的增殖能力。采用Real-time PCR法检测巨噬细胞和A549、NCI-H520细胞中IL-1β mRNA的表达。应用IL-1β的中和抗体抑制IL-1β的活性，观察IL-1β在巨噬细胞促进肺癌细胞增殖中的作用。利用Western blot法检测肺癌细胞中自噬标志物Beclin 1的表达。结果：BrdU-ELISA检测结果：A549细胞与巨噬细胞以1∶0.5的比例共培养，A549细胞的OD值从(0.41±0.06)增加到(1.13±0.10)，差异有统计学意义(P<0.05)，且A549细胞的OD值随共培养巨噬细胞比例的增加而升高(P<0.05)。NCI-H520细胞与不同浓度的巨噬细胞共培养后，NCI-H520细胞的OD值变化趋势与A549细胞相似。Real-time PCR法检测结果：在共培养后，巨噬细胞中IL-1β mRNA的表达显著上调，且有时间依赖性，并显著高于肺癌细胞中的表达。加入IL-1β中和抗体后，BrdU ELISA法检测的细胞增殖，结果显示IL-1β中和抗体可明显抑制巨噬细胞对肺癌细胞A549和NCI-H520的增殖促进作用。Western blot法检测结果显示IL-1β可显著抑制肿瘤细胞Beclin 1的表达。结论：巨噬细胞和肺癌细胞通过增强IL-1β的表达促进肿瘤细胞的增殖。抑制肿瘤细胞的自噬可能是IL-1β促进肺癌发展的作用机制。

巨噬细胞；肺癌；IL-1β；细胞增殖；自噬

肺癌的发病率和死亡率一直居于各种肿瘤的前列，其中非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是最为普遍的肺癌类型，占肺癌发病总数的85%，5年生存率只有15%[1]。临床和实验研究表明炎症与肿瘤有着极为密切的联系[2]。肿瘤微环境中存在的炎症因子对肿瘤形成和发展的每一步都十分重要[3]。IL-1β是IL-1家族最重要的一员，具有强大的前炎症活性，与细胞的恶变，肿瘤的形成及转移有着极为密切的关系[4]。前期有研究发现，在大肠癌中，由巨噬细胞分泌的IL-1β是大肠癌生长的重要因子[5]。在肺癌中，表达上调的IL-1β是炎症促进肺癌形成的重要因素，可显著促进肺癌细胞的增殖和转移[6]。但是前期的肺癌研究只局限在IL-1β对肿瘤的直接作用，没有涉及到肿瘤微环境中包含的炎症免疫细胞如巨噬细胞在其中的作用，因此，IL-1β在肺癌微环境中的表达，及其对肺癌发展的作用和机制至今尚不清楚，还需进一步研究。本研究中，我们将在体外以共培养方式建立肿瘤微环境模型，研究巨噬细胞促进肺癌细胞增殖的效应和机制，并探讨了IL-1β在其中的重要作用，为肺癌的临床治疗提供一个潜在的研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要抗体和试剂 兔抗人Beclin 1抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；重组人IL-1β和人IL-1β中和抗体购自美国R&D公司；免疫球蛋白IgG购自美国Sigma公司；10%胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；Transwell® 插入式细胞培养皿购自美国Corning公司；BrdU-ELISA试剂盒购自瑞士罗氏公司；ECL化学发光剂购自Thermo公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司产品；QPCR SYBR试剂盒购自美国Bio-Rad公司。

1.1.2 细胞来源和培养 肺癌细胞： NCI-H520购自中国科学院上海细胞库，A549细胞购自美国ATCC。巨噬细胞：分离人外周血单核细胞，于含10%FBS的DMEM完全培养基中扩大培养，加巨噬细胞集落刺激因子50 ng/ml继续培养 5 d，形态学和巨噬细胞表面标志分子CD14和CD68鉴定。

1.2 方法

1.2.1 BrdU-ELISA法检测共培养后肺癌细胞的增殖能力 使用Transwell® 插入式细胞培养皿，将肺癌细胞与巨噬细胞在含10%FBS的DMEM培养液中共培养4 d。实验分组：将每株肺癌细胞各分为4组，1组为肺癌细胞单独培养组； 2、3、4组按肺癌细胞和不同比例的巨噬细胞(1∶0.5、1∶1和1∶2)共培养，其中肺癌细胞单独培养在24孔板中，巨噬细胞培养在Transwell®培养皿中。肺癌细胞与不同浓度巨噬细胞共培养4 d后，按照BrdU-ELISA试剂盒操作说明检测各样本的吸光度。

1.2.2 BrdU-ELISA法检测IL-1β对肺癌细胞的增殖能力的影响 实验分组：将每株肺癌细胞各分为3组，第1组为肺癌细胞单独培养组； 第2组为肺癌细胞与巨噬细胞按1∶1的比例共培养组，并加免疫球蛋白IgG作为对照；第3组为肺癌细胞与巨噬细胞按1∶1的比例共培养组，第3组为共培养后，加入10 μg/ml IL-1β中和抗体。按照BrdU-ELISA试剂盒操作说明检测肺癌细胞的增殖能力。

1.2.3 Real-time PCR 检测巨噬细胞和肺癌细胞中IL-1β mRNA的表达 将2×105个肺癌细胞与巨噬细胞按1∶1的比例进行共培养。收集所需细胞，按照试剂盒说明书提取总mRNA，逆转录生成cDNA，实时定量PCR检测IL-1β mRNA的表达。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火45 s，70℃延伸45 s，25个循环；70℃延伸5 min。以β-actin为内参。引物序列如下，IL-1；F:5′-ATGGCAGAAGTACCTAAGCTC-3′；R:5′-TTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAACTCAGT-3′。β-actin，F： 5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3′；R：5′-CTGGTGCCT-GGGGCG-3′。

1.2.4 Western blot法检测Beclin 1蛋白的表达 肺癌细胞经10 ng/ml IL-1β作用到待检时间后，收集细胞，加入细胞裂解液裂解细胞，提取细胞蛋白样品定量。取40 μl总蛋白与等体积2×上样缓冲液混合，变性后上样于10% SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，转膜，用含5%脱脂奶粉封闭，加一抗4℃孵育过夜，经TBS-T充分洗涤，加HRP-羊抗兔抗体，TBS洗涤，用化学发光试剂盒定影显影。

2 结果

2.1 巨噬细胞促进肺癌细胞的增殖 BrdU-ELISA法分析结果显示(表1)，A549细胞与不同比例的巨噬细胞共培养4 d后，与A549细胞单独培养组比较，共培养组的A549细胞的吸光度明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，随着巨噬细胞数量的增多，A549细胞的吸光度增加的越明显，差异有统计学意义(P<0.05)。与不同浓度的巨噬细胞共培养后，NCI-H520细胞的增殖变化趋势与A549细胞相似。提示巨噬细胞可以促进肺癌细胞的增殖，且促进作用随巨噬细胞比例的增加而增加。

LungcancercellsControlLungcancercell：macrophage1∶051∶11∶2FvaluePvalueA549041±006113±0101)232±0301)2)379±0351)2)3)3896001NCI⁃H520031±007071±0061)197±0211)2)345±0231)2)3)744001

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the 1∶0.5 group，2)P<0.05；compared with the 1∶1 group，3)P<0.05.

图1 Real-time PCR 检测IL-1β mRNA在巨噬细胞和A549细胞中的表达Fig.1 Detect expression of IL-1β mRNA in macrophages and A549 cells by Real-time PCRNote: Compared with the macrophages 0 h group，*.P<0.05；compared with the A549 cell 0 h group，#.P<0.05.

图2 Real-time PCR 检测IL-1β mRNA在巨噬细胞和NCI-H520细胞中的表达Fig.2 Detect expression of IL-1β mRNA in macrophages and NCI-H520 cells by Real-time PCRNote: Compared with the macrophages 0 h group，*.P<0.05；compared with the NCI-H520 cell 0 h group，#.P<0.05.

LungcancercellControlLungcancercell∶macrophage=1∶1ControlIgGIL⁃1βneutralizingantibodyFvaluePvalueA549055±003363±033146±0181)5472001NCI⁃H520055±004294±038153±0201)2371001

Note：Compared with the control IgG group，1)P<0.05

2.2 共培养增强巨噬细胞和肺癌细胞IL-1β mRNA的表达 Real-time PCR检测结果显示在与肺癌A549细胞或NCI-H520细胞共培养8 h后，巨噬细胞中IL-1β mRNA的表达显著上调，且随着时间的延长其表达增加(P<0.05,图1、2)。A549细胞和NCI-H520细胞IL-1β mRNA表达也上调，但是上升的幅度显著低于巨噬细胞(图1、2)。

2.3 IL-1β中和抗体抑制巨噬细胞的促肺癌细胞增殖作用 BrdU ELISA法检测的结果显示，A549细胞与巨噬细胞以1∶1的比例共培养后，对照IgG组的A值为(2.95±0.11)，IL-1β中和抗体组的A值为(1.45±0.04)，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。NCI-H520细胞的检测结果与A549细胞相似，提示：IL-1β中和抗体也可抑制A549细胞和NCI-H520细胞的增殖(P<0.05，表2)。

图3 Western blot 检测IL-1β处理肺癌细胞后Beclin 1蛋白的表达Fig.3 Detect expression of Beclin 1 protein in IL-1β treated lung cancer cells by Western blotNote: A.A549 cell;B.NCI-H520 cell Compared with the 0 h group，P<0.05.

2.4 IL-1β对肺癌细胞自噬的影响 Western blot法检测的结果显示，IL-1β分别作用于肺癌细胞A549和NCI-H520后，自噬相关蛋白Beclin 1的表达在两种细胞里随着作用时间地延长逐渐下调，与0 h组相比有统计学差异P<0.05 (图3)。提示IL-1β可降低肺癌细胞的自噬能力。

3 讨论

肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展中的重要作用已被生物医学界广泛认可，但具体的作用机制现仍不清楚。在本研究中我们发现，巨噬细胞与肺癌细胞共培养时，巨噬细胞促进了肺癌细胞增殖，肺癌细胞增强了巨噬细胞IL-1β的表达；IL-1β下调肿瘤细胞Beclin 1表达，抑制细胞自噬。提示对肺癌细胞自噬能力的影响可能是IL-1β促进肺癌细胞增殖的作用机制。

在肿瘤发生发展过程中，常有炎症细胞如巨噬细胞的浸润，这也是肿瘤的重要特征[7]。肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是渗入肿瘤组织的巨噬细胞，其数量与肿瘤的预后不良关系密切[8]。激活的TAMs渗入到肿瘤微环境中，通过自分泌和旁分泌的方式产生细胞因子和趋化因子，调控肿瘤的生长[9]。在巨噬细胞缺陷的小鼠中，肿瘤的生长和转移几乎被完全抑制[10,11]。抑制小鼠炎症免疫细胞的NF-κB信号途径，显著抑制小鼠肺部炎症反应，导致小鼠肺肿瘤生长阻滞[7,9]。前期我们的研究发现[7]，在人类肺腺癌和鳞癌组织中有大量的巨噬细胞浸润，而正常的肺组织中仅有少量巨噬细胞。本研究结果显示，巨噬细胞可以显著促进2株肺癌细胞株A549细胞和NCI-H520细胞的增殖，并且具有明显的巨噬细胞数量依赖性。但是巨噬细胞浸润与肺癌的发展还存在争议。Koukourakis等[12]发现在Ⅰ～Ⅱ期的非小细胞肺癌患者中，巨噬细胞数量决定了肺癌患者的预后，巨噬细胞浸润数量越多，患者预后越差。而在Kerr[13]的研究中，发现在对肿瘤生长抑制的非小细胞肺癌标本分析中，高巨噬细胞数目与肿瘤的生长抑制存在正相关。不同的巨噬细胞评价方法可能是导致结论不一致的原因，这一问题将有待今后进一步研究。

现已有研究表明[14]，巨噬细胞可产生多种细胞因子，对肿瘤的增殖和发展具有重要作用，如白介素、肿瘤坏死因子等。IL-1β是巨噬细胞表达的重要前炎症因子，多个研究发现IL-1β对肺癌，大肠癌等肿瘤的发展具有促进作用[4,6]。其机制包括：IL-1β可通过激活大肠癌的wnt信号途径促进肿瘤细胞的生长[15]；IL-1β具有血管生成功能，可以增加肺肿瘤周围的血管形成[15]。IL-1β通过抑制肺癌细胞microRNA-101/Lin28B 途径促进肺癌的发展[6]。本研究采用肺癌细胞与巨噬细胞共培养，检测巨噬细胞和肿瘤细胞中IL-1β 的表达。结果显示，当肺癌细胞与巨噬细胞共培养时，巨噬细胞中的IL-1β表达显著增强，且高于肺癌细胞IL-1β的表达，提示共培养时IL-1β的表达和分泌主要来源于巨噬细胞。进一步采用IL-1β中和抗体抑制IL-1β，结果显示巨噬细胞促进肺癌细胞增殖的能力明显减低，证实巨噬细胞释放的IL-1β是其促进肿瘤细胞增殖的关键因素。

IL-1β可被多种炎症中介物调控表达，是巨噬细胞分泌的主要炎性细胞因子之一[4,5]。研究发现[5]，肺癌病人的肺泡巨噬细胞分泌的IL-1β远高于同一病人外周血单核细胞，显示了其在肿瘤发展中的作用。IL-1β通过诱导GSK3β磷酸化，稳定β-catenin，增强TCF依赖的基因活性，从而激活肿瘤细胞Wnt/β-catenin信号途径促进肿瘤增殖[5]。自噬(Autophagy)是一个受到高度调控的对细胞内物质进行周转的重要过程[16]。该过程中一些临时的或损坏的蛋白质和细胞器通过溶酶体进行降解并得以循环利用，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新[9]。自噬可出现在机体的多种生理和病理过程，其所起的作用是正面还是负面的尚未完全阐明，对肿瘤的研究尤其如此，值得关注[17]。我们的结果发现，IL-1β的刺激显著降低肺癌细胞Beclin1蛋白的表达。Beclin1是一种肿瘤抑制蛋白，是哺乳动物参与自噬的特异性基因，刺激自噬的发生[16]。结果提示，IL-1β很可能通过抑制Beclin1的表达，进而抑制肺癌细胞自噬的发生，导致肺癌细胞增殖增强。已有研究表明，在乳腺癌小鼠模型中，抑制肿瘤细胞Beclin1基因表达，显著增加小鼠肿瘤的数量，加快肿瘤的生长。而在肝细胞癌肺转移小鼠模型，通过沉默Beclin1基因抑制自噬，却显著降低肝细胞癌的肺转移。因此，IL-1β在小鼠肺癌模型中是否通过调控肿瘤细胞自噬相关蛋白抑制自噬，从而促进肿瘤生长还需要进一步研究。

综上所述，本研究结果显示，肺癌细胞与巨噬细胞共培养，巨噬细胞能促进肺癌细胞增殖，肺癌细胞增强了巨噬细胞中IL-1β的表达，IL-1β可下调肿瘤细胞自噬能力。

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[收稿2016-06-25 修回2016-09-21]

(编辑 许四平)

Study on mechanisms of IL-1β promoted lung cancer cells proliferation

SHIYu-Rong,WUJun-Lu,QUANWen-Qiang,LIDong.

DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BengbuMedicalCollege，Bengbu233000，China

Objective:To investigate the mechanisms of IL-1β promoted lung cancer cells proliferation.Methods: The “Transwell® Inserts” system was used to coculture lung cancer cells A549，NCI-H520 with macrophages.BrdU ELISA used to measure the effect of macrophages promoted lung cancer cells proliferation.Expression of mRNA of IL-1β in A549 and NCI-H520 cells were analysed by Real-time PCR analysis.IL-1β was responsible for macrophage-promoted lung cancer cells growth,IL-1β neutralizing antibody was added.The autophagy marker Beclin1 protein was detected by Western blot.Results: The BrdU ELISA assay showed that after coincubation with macrophages in the proportion of 1∶0.5,the OD value of A549 increased from(0.41±0.06)to(1.13±0.10).There was statistical significance(P<0.05).It also showed that the growth of the A549 cell was dependent on the macrophage number(P<0.05).The OD value variability of NCI-H520 cells was as same as A549 cell upon cocultured with macrophages.Real-time PCR results showed that the expression of IL-1β mRNA in macrophages was remarkably enhanced in a time dependent manner upon coincubated with lung cancer cell,and the expression level was higher than lung cancer cells.Addition of IL-1β neutralizing antibody markedly inhibited macrophage-promoted lung cancer cells proliferation.The OD value of these two cells were decreased from(3.63±0.33) to (1.46±0.18),from (2.94±0.38) to (1.53±0.20),respectively (P<0.05).After treatment with IL-1β,the expression of Beclin1 was significantly inhibited in tumor cells.Conclusion: Over-expression of IL-1β from macrophages and lung cancer cells is responsible for proliferation of tumor cells in coculture condition.Inhibition of autophagy in tumor cells may be the important mechanisms of IL-1β promotes lung cancer cells proliferation.

Macrophages；Lung cancer；IL-1β；Cell proliferation；Autophagy

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.004

①本文为国家自然科学基金(81272603，81472179)和安徽省自然科学基金(KJ2014A162)资助项目。

石玉荣(1974年-)，女，硕士，副教授，主要从事肿瘤分子生物学方面的研究。

R734.2

A

1000-484X(2017)01-0020-05

②同济大学附属同济医院检验科，上海200065。

③通讯作者，E-mail: 186ld@163.com。