淫羊藿苷对实验性IgA肾病大鼠的作用及相关机制

张 红, 刘 念, 李 征

(郑州大学附属南阳市中心医院 1.肾病风湿免疫科；2.骨二科；3.泌尿外科，河南 南阳 473400)

淫羊藿苷对实验性IgA肾病大鼠的作用及相关机制

张 红1*, 刘 念2, 李 征3

(郑州大学附属南阳市中心医院 1.肾病风湿免疫科；2.骨二科；3.泌尿外科，河南 南阳 473400)

目的 探究不同剂量的淫羊藿苷对实验性IgA肾病大鼠的影响，并研究其相关作用机制。 方法 建立实验性IgA肾病大鼠模型，实验共分为5组，正常对照组(con)，造模组(IgA)，淫羊藿苷低剂量组(ICA-L)，淫羊藿苷中剂量组(ICA-M)和淫羊藿苷高剂量组(ICA-H)；各组经相应处理后，测定各组大鼠尿红细胞、尿蛋白和尿NAG水平；免疫荧光染色检测IgA沉淀情况；免疫组化染色法与实时荧光定量PCR分别检测NF-κBp65与MCP-1的蛋白表达水平和IL-4，IL-10与IL-13的mRNA表达变化。 结果 给予淫羊藿苷处理后，降低实验性IgA肾病大鼠的尿红细胞、尿蛋白和尿NAG水平与减少IgA沉淀，并降低NF-κBp65与MCP-1的蛋白表达水平和IL-4，IL-10与IL-13的mRNA表达。 结论 淫羊藿苷对实验性IgA肾病有一定的疗效，可能与调控NF-κBp65，MCP-1因子的表达以及机体免疫调节有关。

淫羊藿苷；IgA肾病；NF-κBp65；MCP-1；IL-4；IL-10；IL-13

IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)是最常见的原发性肾小球疾病之一，主要表现为肾小球系膜区IgA沉积，伴随膜细胞增生和系膜基质扩张[1]。临床病状表现多样，主要有肾病综合征、高血压、急性肾炎与肾功能不全等，既往认为IgA肾病患者的预后良好，但仍有25%～30%的患者最终发展为终末期肾病[2]。IgA肾病及导致得肾衰竭给患者造成严重的健康困扰及沉重的经济分担。因此，有效地预防及治疗IgA肾病是临床急切需要解决的难题。

淫羊藿苷(Icariin，ICA)是小檗科淫羊藿属淫羊藿茎叶的主要活性成分之一。主要具有免疫调节，抗肿瘤，促进骨细胞发育和心血管系统等药理作用。吴东方等[3]研究发现淫羊藿苷通过抑制肾皮脂质过氧化物的产生与减轻谷胱甘肽的消耗，从而降低肾损伤大鼠的血肌酐和尿素氮水平。另外，陈香美等[4]研究发现淫羊藿苷能够增加Na+-K+-ATP酶活性，减轻庆大霉素对肾小管与肾间质的损伤。此外，研究表明淫羊藿苷还可增强血凝素，从而诱生IL-2、IL-3和IL-6的作用，与剂量呈正相关，通过促进IL-2的含量提高淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤细胞和B细胞的功能[5]。随着淫羊藿苷的药理作用研究的不断深入，临床上疗效也显示出巨大的优势。我们通过建立IgA肾病大鼠模型，探讨不同剂量的淫羊藿苷对IgA肾病的作用，并研究其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠50只，体重180～200 g，雌雄各半，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，[SCXK(京)2014-0009]。饲养于南阳理工学院中医学实验中心SPF级动物房，实验动物使用许可证号[SYXK(豫)2014-0006]，相对湿度45%～75%。并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 主要试剂

淫羊藿苷(Icariin)购自西安小草植物科技有限公司，纯度>98%；牛血清白蛋白购自北京希凯创新科技有限公司；脂多糖购自Sigma公司，NF-κBp65与MCP-1抗体购自博士德生物工程有限公司；IL-4，IL-10，IL-13引物购自广州迈博生物科技有限公司；其他试剂购自国产分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 动物造模与分组

将健康SD大鼠进行1周的适应性喂养，造模方法按照汤颖等[6]实验性IgA肾病模型进行，除正常对照组(control group)外，其余各组大鼠用400 mg/kg 10%牛血清白蛋白灌胃，每日一次，直至实验结束，共21周；于第6周和第8周末尾静脉注射0.05 mg脂多糖，每只每次；每周末皮下注射蓖麻油0.5 mL与四氯化碳0.1 mL，共给药9周；正常对照组在相应时间等体积给予蒸馏水灌胃，生理盐水皮下注射和尾静脉注射。于第9周末，心脏取血处死4只模型组大鼠，取肾脏组织做免疫荧光检查，其余大鼠随机分为造模组(IgA group)，淫羊藿苷低剂量组(ICA-L group)，淫羊藿苷中剂量组(ICA-M group)和淫羊藿苷高剂量组(ICA-H group)，在第9周末开始，淫羊藿苷低剂量组，淫羊藿苷中剂量组和淫羊藿苷高剂量组分别灌胃60 mg/kg，90 mg/kg和120 mg/kg，每日一次，直至实验结束，共12周，试验中并无大鼠死亡。

1.3.2 尿红细胞、尿蛋白和尿NAG水平的测定

于21周末，将大鼠置于代谢笼中，饮食正常，收集24 h尿液，测量尿液中尿红细胞、尿蛋白和尿NAG的水平。

1.3.3 免疫荧光染色

处死大鼠后，摘除肾脏，用组织包埋剂OCT包埋后，置于-80℃液氮中冷冻，切片，晾干，PBS洗涤3次，滴入加FITC标记的IgA抗体(1∶50)，置于37%孵育30 min，PBS洗涤，滴入甘油封片，置于荧光显微镜观察IgA的沉淀情况与绿色荧光的强度。

1.3.4 免疫组化染色

将大鼠肾组织制成石蜡切片，置于80℃烘箱60 min，分别浸泡于二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，再置于梯度酒精(100%、95%、85%、75%)浸泡5 min，PBS冲洗，置于3% H2O2浸泡8 min，PBS冲洗，加入8%山羊血清封闭，孵育10 min，滴入一抗，4℃孵育过夜，PBS冲洗，加入相应带生物素标记的二抗，37℃孵育20 min，加入DAB显色剂，自来水冲洗，苏木素复染，1%盐酸分化，碳酸锂溶液蓝化，梯度酒精脱水(75%，85%，95%，100%)，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，中性树脂封片，置于光学显微镜下观察。

1.3.5 实时荧光定量PCR(qPCR)

取各组大鼠肾脏组织，依据Trizol说明书要求，提取总RNA，反转录合成cDNA，采用PCR仪进行扩增，所用引物序列如表1所示。扩增条件：94℃ 30 s，63℃ 30 s，73℃ 45 s，共34个循环，74℃延伸5 min。实验结果在荧光定量操作系统中进行分析对比，目标基因的相对定量用2-△△CT计算。

表1 引物序列

表2 尿红细胞、尿蛋白和尿NAG水平变化(±s，n=10)

Tab.2 The change of urine erythrocyte, urinary protein and urinary NAG content

表2 尿红细胞、尿蛋白和尿NAG水平变化(±s，n=10)

组别Group尿红细胞(per/μL)Urineerythrocyte尿蛋白(mg/L)Urinaryprotein尿NAG(U/L)UrinaryNAG正常对照组Controlgroup712±3．57853±4．38097±0．47造模组IgAgroup39186±13．94a6218±11．73a612±1．64a淫羊藿苷低剂量组ICA⁃Lgroup26428±18．57ab4867±8．34ab453±1．57ab淫羊藿苷中剂量组ICA⁃Mgroup17362±15．82ab3246±4．57ab283±0．83ab淫羊藿苷高剂量组ICA⁃Hgroup8634±9．34ab1834±2．37ab176±0．37ab

注：与正常对照组相比，aP< 0.05；与IgA组相比，bP< 0.05。

Note.aP< 0.05 vs control group.bP< 0.05 vs IgA group.

1.4 统计学方法

采用SPSS16.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示；组间采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P< 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 尿红细胞、尿蛋白和尿NAG水平

与control组相比，IgA组大鼠的尿红细胞、尿蛋白和尿NAG水平均显著升高(P< 0.05)，给予淫羊藿苷干预后，随剂量增大尿红细胞、尿蛋白和尿NAG水平逐渐下降，如表2所示。

2.2 肾组织IgA免疫荧光检测结果

如图1所示，control组不出现IgA沉淀；IgA组大鼠肾小球系膜区出现弥漫性颗粒状沉淀，强阳性绿色荧光，呈弥漫性团块状；给予淫羊藿苷干预的大鼠肾组织沉淀较少，呈弱绿色荧光，并随剂量升高荧光强度减弱。

2.3 肾组织的NF-κBp65与MCP-1的蛋白表达水平

如图2,3所示，control组肾组织中NF-κBp65与MCP-1蛋白少量表达；与control组相比，IgA组中NF-κBp65与MCP-1的蛋白表达显著升高，呈强阳性表达；与IgA组相比，给予淫羊藿苷干预后，随剂量增大，NF-κBp65与MCP-1的蛋白表达逐渐减弱。

2.4 肾组织中IL-4， IL-10与IL-13的mRNA表达变化

如图4所示，与control组相比，IgA组中IL-4，IL-10和IL-13的mRNA表达显著升高(P< 0.05)；与IgA组相比，给予淫羊藿苷干预后，随剂量增大，IL-4，IL-10和IL-13的mRNA表达逐渐减弱。

图1 肾组织IgA免疫荧光检测结果Fig.1 The immunofluorescence result of IgA

图2 免疫组化染色检测NF-κBp65蛋白的表达变化Fig.2 The protein expression of NF-κBp65

图3 免疫组化染色检测MCP-1蛋白的表达变化Fig.3 The protein expression of MCP-1

注： aP < 0.05 vs con组； bP < 0.05 vs IgA组。图4 淫羊藿苷对 IL-4， IL-10与IL-13 mRNA表达变化的影响(±s，n=3)Note. aP < 0.05 vs control group. bP < 0.05 vs IgA group.Fig.4 The effect on the mRNA expression of IL-4, IL-10 and IL-13 by icariin

3 讨论

本试验采用联合牛血清白蛋白+脂多糖+蓖麻油+四氯化碳方法进行造模，通过免疫荧光结果显示造模组大鼠肾小球系膜区出现弥漫性颗粒状沉淀，符合IgA肾病的病理变化，提示本试验IgA肾病大鼠模造模成功。蛋白尿是IgA肾病患者最常出现的临床症状，蛋白尿是引起肾小管间质损害的因素之一，使肾小管细胞缺氧导致肾小管上皮细胞萎缩[7]。本试验显示淫羊藿苷明显减轻IgA肾病大鼠的尿红细胞、尿蛋白和尿NAG水平，从而减少对肾小管间质的损害。

核转录因子κB是转录因子家族的重要成员，主要参与免疫反应、淋巴细胞分化、细胞内信号传导，参与多种调控多种炎症细胞因子和趋化因子的合成[8]。NF-κB参与调控IL-2、IL-6、IL-8、MCP-1等参与多种肾脏疾病发生发展过程[9]。通常NF-κB与多肽p65和p50蛋白亚基组成二聚体，但只有p65在蛋白c末端含有转录激活区域[10]。MCP-1是单核巨噬细胞最重要的趋化和活化因子。研究表明NF-κB在肾小球肾炎模型中活性显著增强，且MCP-1的表达上调，抑制NF-κB后MCP-1的表达下调，提示MCP-1的表达与NF-κB密切相关[11,12]。在IgA肾病中蛋白尿可引起NF-κB的活化，从而增强MCP-1的表达，引起单核细胞趋化浸润激活[13]。本试验研究发现淫羊藿苷抑制IgA肾病中NF-κB与MCP-1的表达，并与剂量呈正相关，提示淫羊藿苷可能通过抑制NF-κB与MCP-1的表达，从而抑制单核细胞的趋化浸润，从而减轻对肾间质的损伤。

IL-4，IL-10与IL-13主要是由Th2细胞产生，具有普遍抑制炎症细胞因子的作用，促进抗体的生成，介导体液免疫应答。其中IL-4与IL-13是可直接影响IgA源性B细胞的增殖和活化，影响抗体的分泌，对肾小管上皮细胞造成一定的损伤。已有研究发现IL-4与IL-13对肾小管上皮细胞的形态和功能有所影响，进而对肾小管上皮细胞造成损伤[14]。徐勇等[15]研究发现联合应用IL-4与IL-10可抑制中性白细胞浸润，对肾缺血在灌注损伤的大鼠有肾保护的作用。本研究发现，淫羊藿苷通过抑制IgA肾病大鼠肾组织中IL-4，IL-10与IL-13的表达，从而对肾具有保护作用。

综上所述，淫羊藿苷对Ig肾病具有一定的疗效，可能与淫羊藿苷对NF-κB与MCP-1因子的表达的影响，以及机体免疫调节有关。

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专家问答

问：不同类型的糖尿病动物模型血糖检测在何时进行合适？

答：DM动物模型分为 1型糖尿病(T1DM)模型和2型糖尿病(T2DM)模型，T1DM动物模型主要检测空腹血糖，而T2DM动物模型除检测空腹血糖外，同时还检测餐后血糖和随机血糖，因此，不同类型的DM模型的血糖检测时间和要求也是不同的。

1、空腹血糖检测的合适时间

(1)T1DM动物模型空腹血糖检测的合适时间，一般在早上8:00～9:00，大动物要求提前禁食不禁水12 h以上，啮齿类动物T1DM模型提前禁食不禁水要求10～12 h。

(2)T2DM动物模型空腹血糖检测的合适时间：大鼠、小鼠等啮齿类动物T2DM模型空腹血糖的合适检测时间是在下午4:00～5:00，大鼠提前禁食不禁水6～8 h，小鼠提前禁食不禁水5～6 h。其它动物T2DM模型空腹血糖的合适检测时间在早上8:00～9:00，要求提前禁食不禁水12 h以上。

2、餐后血糖检测的合适时间

餐后血糖通常是口服葡萄糖耐量试验(OGTT)2 h血糖，也有研究者采用动物进食后2 h或3 h血糖。餐后血糖检测的合适时间，一般在早上8:00～9:00，大动物要求提前禁食不禁水12 h以上，啮齿类动物DM模型禁食不禁水要求10～12 h。

3、随机血糖检测的合适时间

大鼠、小鼠等啮齿类动物T2DM模型的合适检测时间是在上午未加喂饲料前或在加喂饲料后3 h至下午加喂饲料前。其它一日二餐定时饲喂的动物，T2DM模型随机血糖的合适检测时间是在上午饲喂后3 h至下午饲喂前。

(感谢浙江中医药大学动物实验研究中心 陈民利 教授的解答)

Effects of Icariin of experimental IgA nephropathy in rats

ZHANG Hong1，LIU Nian2，LI Zheng3

(1.Department of Nephropathy Rheumatology,2.Department of Orthopaedics, 3.Department of Urology, Nanyang Central Hospital of Zhengzhou University, Nanyang 473400, China)

Objective To investigate the effect of Icariin (ICA) experimental IgA nephropathy in rats and to explore related mechanisms. Methods Experimental IgA nephropathy rat model was established and then model rat were treated with or without different doses of ICA. Then, urine RBC, Urine protein and urine NAG were analyzed; IgA precipitation was detected with immunofluorescence staining; the protein level of NF-κBp65 and MCP-1 were examined by immunohistochemical staining; the mRNA level of IL-4, IL-10 and IL-13 were determined by quantitative PCR. Results The concentrations of urine RBC, Urine protein and urine NAG were reduced after ICA treatment, as companied by a decrease of IgA precipitation. Moreover, ICA treatment also decreased the protein level of NF-κBp65 and MCP-1, and the mRNA level of IL-4, IL-10 and IL-13. Conclusions ICA exerts a certain degree of efficacy on the treatment of experimental IgA nephropathy through regulating NF-κBp65 and MCP-1 expression and the immunoregulation mechanism.

Icariin; IgA nephropathy; NF-κBp65; MCP-1; IL-4; IL-10; IL-13

张红(1980-)，女，主治医师，硕士，研究方向：肾病风湿免疫方向。E-mail：nyzhanghong@126.com

研究报告

【文献标识码】 A 【文章编号】1671-7856(2017) 01-0073-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.015

2016-04-06