抑制IGFBP2、IGFBP3在卵巢肿瘤中的表达对卵巢癌的迁移、侵袭的影响

李 君，刘恩令，杨 丽

(唐山市工人医院产科，河北 唐山 063000)

抑制IGFBP2、IGFBP3在卵巢肿瘤中的表达对卵巢癌的迁移、侵袭的影响

李 君，刘恩令*，杨 丽

(唐山市工人医院产科，河北 唐山 063000)

目的 研究抑制IGFBP2、IGFBP3在卵巢肿瘤中的表达对卵巢癌的迁移侵袭的影响。方法 采用siRNA干扰IGFBP2、IGFBP3在卵巢癌细胞株SKOV3中的表达，CCK-8试剂盒检测SKOV3的增殖情况，流式细胞术检测SKOV3的凋亡情况，transwell实验、细胞划痕愈合实验检测SKOV3的迁移与侵袭；CCK-8法检测不同浓度顺铂(5、10、20 μg/mL) 对SKOV3细胞生长的影响。结果 采用siRAN干扰IGFBP2、IGFBP3在卵巢癌SKOV3中表达后，与对照组相比SKOV3细胞增殖能力下降，凋亡增加，迁移与侵袭功能下降。结论 抑制IGFBP2、IGFBP3在卵巢肿瘤中的表达对卵巢癌的迁移与侵袭起一定的抑制作用。

IGFBP-2;IGFBP-3;卵巢癌;耐药

卵巢癌在近几年发病率明显上升，对女性健康造成了极大的威胁。卵巢癌是妇科肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤,在女性中发病率占恶性肿瘤总数的4%。在女性生殖道癌瘤中卵巢恶性肿瘤发病率中占第2位,同时，卵巢恶性肿瘤占生殖道恶性肿瘤的22.90%。妇科的主要致死性疾病为卵巢上皮性癌,到目前为止，没有有效的早期诊断方法，70%的病例在就诊时已属晚期，5年生存率低于30%[1]。在卵巢癌患者中发现许多基因异常表达，其中p53、胰岛素样生长因子(insulin like growth factor,IGF)已发现在卵巢癌中异常表达[2,3]。胰岛素样生长因子(insulin like growth factor, IGF) 家族在肿瘤细胞的发生、发展及其转化过程中正日益受到重视。胰岛素样生长因子系统由IGF及其受体和胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin like growth factor binding protein,IGFBP)及IGFBP 蛋白酶组成，近来发现该家族与p53同样参与细胞凋亡的调控及恶性肿瘤的发生发展。本研究通过抑制IGFBP2、IGFBP3在卵巢肿瘤中的表达，探讨其对卵巢癌的迁移侵袭及耐药的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

SKOV3细胞购自中科院上海生化细胞所；顺铂购自山东齐鲁制药有限公司；1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；Si-RNA IGFBP-2、Si-RNA IGFBP-3引物由广州锐博生物有限公司合成；流式细胞凋亡Annexin V/PI双染检测试剂盒购自上海生工有限公司；transwell小室购自NEST公司;流式细胞仪购自BD生物有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

复苏SKOV3细胞于含10%胎牛血清的1640培养基，在37℃、5% CO2恒温培养箱中常规培养，并每天观察细胞状态，隔天换液传代。

1.2.2 Si-RNA干扰实验

(1)在6孔板中每孔接种2×105个细胞，每孔加入2 mL完全培养基，放在细胞培养箱中培养过夜。(2)当细胞融合度达到50%～80%时，在超净台中用无菌离心管中按照说明书配制溶液A和溶液B。将溶液A加入到溶液B中，轻轻吹打混匀，室温孵育30 min。用2 mL左右PBS洗涤细胞，确保将血清全部洗去，每孔加入0.8 mL无血清培养基，将混合后的AB液滴加到孔中，轻轻摇晃混匀，放在细胞培养箱中孵育8 h～12 h后换液，加入新鲜的完全培养基，继续培养。(3)36 h～72 h后采用RT-PCR或Western blot检测干扰的效果。

1.2.3 CCK-8检测细胞增殖

复苏细胞进行培养，待细胞在大皿中呈指数期增长时进行种板(96孔板)，每孔接种细胞数2000个，待细胞贴壁后进行换液干扰实验),分别在0 h和24 h时每孔加入10 uL CCK-8,设置对照组。细胞培养箱孵育4 h后，37℃摇床慢摇10分钟用酶标仪测570 nm的OD值。

1.2.4 流式细胞术实验

用胰酶消化细胞，每个样本细胞数大约为5×105个，离心5 min后弃去培养液，用PBS洗2～3次,1000 r/min离心5 min弃去PBS后用100 μL的Bangdingbuffer重悬细胞，轻轻吹打均匀加入5 μL的PI,室温下避光孵育10～15 min后(不要超过30 min)流式细胞仪检测。

1.2.5 细胞划痕实验

(1)在6孔板背后，用marker笔均匀的划横线，横线要横穿过孔，可以用直尺比着，大约每隔0.5～1 cm一道。每个孔上面至少要划5条线。(2)在每个孔中种下5×105个干扰或未干扰的细胞，具体数量要根据细胞的增殖情况决定，细胞过夜后融合度能够达到80%～90%为宜。(3)第二天用枪头划痕，划痕时枪头要垂直，使得划痕尽量垂至于背后的横线。(4)用PBS洗细胞3次，加入无血清培养基放入细胞培养箱中培养。分别在0 h，24 h时进行取样，拍照。

1.2.6 transwell 实验

提前一天用无血清无双抗的1640培养基将transwell小室水化过夜，第二天消化收集干扰及未干扰的细胞，将细胞浓度调整到1×105/mL备用。轻轻吸去transwell上室内液体，加入600 uL的完全培养基，同时在小室内加入100 uL细胞悬液。在细胞培养箱中孵育48 h后取出transwell 小室，用PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定10 min左右，用棉签小心擦去微孔膜上层的细胞，用4 g/L台盼蓝溶液染色，在倒置显微镜下计数迁移到微孔膜下层的细胞。

1.2.7 顺铂耐药实验

将干扰或未干扰的细胞96孔板接种，每孔细胞数量为2000个，细胞贴壁后加入不同浓度的顺铂(5、10、20 μg /mL)，24 h后换液加入10 uL CCK-8,设置对照组。细胞培养箱孵育4 h后，37℃摇床慢摇10 min用酶标仪测570 nm的OD值。计算细胞存活率。

1.3 统计方法

数据采用SPSS 16.0进行统计分析，两组之间比较采用t检验，P< 0.05，表示有统计学意义。

2 结果

2.1 转染Si-IGFBP2，Si-IGFBP3效果

干扰SKOV3细胞中IGFBP2、IGFBP3后可以发现细胞中IGFBP2、IGFBP3的蛋白表达水平与对照组相比明显降低。(见图1)

图1 转染SiRNA IGFBP2，SiRNA IGFBP3效果Fig.1 The transfection effect of SiRNA IGFBP2，SiRNA IGFBP3

2.2 转染siRNA IGFBP2，siRNA IGFBP3对SKOV3细胞增殖能力的影响

转染siRNA IGFBP2，siRNA IGFBP3后分别在0 h、24 h检测了细胞增殖情况，结果发现，在0 h时转染siRNA IGFBP2，siRNA IGFBP3组的细胞增殖能力与对照组相比，差异无统计学意义，在24 h时转染siRNA IGFBP2，siRNA IGFBP3组的细胞增殖能力与对照组相比，差异具有统计学意义(P< 0.01)。(见图2)

注：与对照组相比较，**P < 0.01，***P < 0.001。图3 转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3对SKOV3细胞凋亡的影响(n=3) Note. Compared with the NC group，**P < 0.01，***P < 0.001.Fig.3 The apoptosis of SKOV3 cells after transfection siRNA IGFBP-2, siRNA IGFBP-3

注：与对照组相比较，**P < 0.01。图2 转染siRNA IGFBP2，siRNA IGFBP3对SKOV3细胞增殖能力的影响(n=3)Note. Compared with the NC group，**P < 0.01.Fig.2 The effect on SKOV3 cell proliferation after transfection siRNA IGFBP2, siRNA IGFBP3

2.3 转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3对SKOV3细胞凋亡的影响

转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3后分别在24 h检测了细胞凋亡情况，结果发现，在24 h时转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3组的细胞凋亡百分比与对照组相比，差异具有统计学意义(P< 0.01，P< 0.001)。(见图3)

2.4 转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3对SKOV3细胞迁移能力的影响

为观察IGFBP-2、IGFBP-3对SKOV3细胞迁移能力的影响，SKOV3细胞转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3后分别在0 h、24 h检测了细胞迁移能力，结果发现，转染0 h时，3组无明显差别，转染24 h后，与对照组相比，转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3明显降低了SKOV3细胞的迁移能力，差异具有统计学意义(P< 0.01，P< 0.001)。(见图4)

2.5 转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3对SKOV3细胞侵袭能力的影响为观察IGFBP-2、IGFBP-3对SKOV3细胞侵袭能力的影响，SKOV3细胞转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3后在24 h检测了细胞侵袭能力，结果发现转染24 h后，与对照组相比，转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3明显降低了SKOV3细胞的侵袭能力，差异具有统计学意义(P< 0.01)。(见图5)

2.6 转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3对SKOV3细胞顺铂耐药性的影响为观察IGFBP-2、IGFBP-3对SKOV3细胞耐药性的影响，SKOV3细胞转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3后加入不同浓度的顺铂(5、10、20 μg/mL)，在24 h后检测了细胞存活情况，结果发现，与对照组相比，转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3明显降低了SKOV3细胞的耐药性，加入顺铂浓度为5 μg/mL、10μg/mL时细胞存活数量减少，与对照组相比差异具有统计学意义(P< 0.05)，加入顺铂浓度为20 μg/mL时细胞存活数量明显减少，与对照组相比差异具有统计学意义(P< 0.01)。(见图6)

注：与对照组相比较，**P < 0.01，***P < 0.001。图4 转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3对SKOV3细胞迁移能力的影响(n=3)Note. Compared with the NC group，**P < 0.01，***P < 0.001.Fig.4 The effect on migration of SKOV3 cells after transfection siRNA IGFBP -2, siRNA IGFBP-3

注：与对照组相比较，**P < 0.01。图5 转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3对SKOV3细胞侵袭能力的影响(n=3)Note. Compared with the NC group，**P < 0.01.Fig.5 The effect on invasion of SKOV3 cells after transfection siRNA IGFBP -2, siRNA IGFBP-3

注：与对照组相比较，*P < 0.05，**P < 0.01。图6 转染siRNA IGFBP-2，siRNA IGFBP-3对SKOV3细胞顺铂耐药性的影响(n=3)Note. Compared with the NC group，*P < 0.05，**P < 0.01.Fig.6 The effect on drug resistance of SKOV3 cells after transfection siRNA IGFBP -2, siRNA IGFBP-3

3 讨论

卵巢癌主要的治疗方法为手术治疗、放化疗等，但治疗后3～5年的复发率为70%左右，复发后患者的治疗效果极差，并且对多种化疗药物出现耐药性[4]，因此，分子靶向治疗将是卵巢癌治疗的重要方向。在大多数的恶性肿瘤中均有基因突变现象，针对突变基因进行精准治疗，对患者的治疗效果及化疗药的耐药性会有明显改善。

IGFBP2，IGFBP3是胰岛素样生长因子家族的重要成员，在人的生长发育过程中起着非常重要的作用[5,6]。目前发现在结肠癌、前列腺癌及卵巢癌等患者体内出现异常高表达[7-9]。有研究认为IGFBP2高表达可促进肿瘤细胞的增殖，而IGFBP3的高表达可抑制肿瘤的增殖与迁移[10]，并且IGFBP2，IGFBP3的表达与肿瘤分期及预后密切相关[11]。本研究通过干扰卵巢癌细胞中IGFBP2，IGFBP3的表达，观察对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、耐药的影响。有研究表明，IGFBP-2 在卵巢癌中发挥重要的生物学作用是通过在卵巢恶性肿瘤组织、患者血清和囊液中过表达[12,13]。Lee EJ等[14]通过侵袭实验已经证明了IGFBP-2 能刺激SKOV3 细胞侵袭，通过siRNA 来抑制它的表达而刺激作用减弱。Torng PL等[15]的研究表明IGFBP-3在人卵巢子宫内膜样癌OVRW59-P4细胞系中能抑制细胞迁移、侵袭和转移。本研究中干扰IGFBP2，IGFBP3在卵巢癌中的表达后发现卵巢癌细胞增殖受到明显抑制，凋亡增加了10倍左右，迁移与侵袭也受到了不同程度的抑制作用。与 Lee EJ等人的研究结果一致，而与Torng PL等人的研究结果有一定的差异，这可能与IGFBP3在肿瘤细胞中的双重作用有关。一方面，IGFBP3可以与IGF形成三元络合物，抑制IGF的促有丝分裂作用，该过程是通过ALS进行的。另一方面，IGFBP3也可通过与IGF的结合有效地延长IGF的半衰期而提高IGF在组织的生物利用率，因为在络合物中IGF的半衰期为15 h，而游离的IGF半衰期为20～30 min，所以IGFBP3是IGF的循环库。IGFBP3的这两种作用受许多因素调节，所以这可能是造成IGFBP3在肿瘤中作用不一致的原因之一。IGFBP3不仅可以通过IGF发挥作用，有报道IGFBP3也可以通过其他途径发挥作用，但具体机制还需进一步研究。因此，IGFBP通过与IGFR竞争性的与IGF结合,以IGF依赖性和非依赖性等方式发挥作用,在恶性肿瘤的侵袭、迁移发展过程中发挥重要作用。IGFBP2有促进肿瘤细胞迁移、侵袭作用是因为IGFBP2能使基质金属蛋酶表达增加，而基质金属蛋白酶的作用是降解细胞外基质,从而促进了肿瘤细胞向周围正常组织的迁移与侵袭。

顺铂是一种常用的化疗药，其治疗恶性肿瘤效果显著，但是副作用较多，并且有些肿瘤已经对顺铂产生了耐药性，有研究表明肿瘤的发生以及对药物的耐受与肿瘤的凋亡抑制密切相关[16]。有研究表明多数卵巢癌细胞系及所有卵巢上皮性癌组织均表达IGF-1R[17-18]。并且IGF-1R可促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和转移，与卵巢癌的发生、发展和预后密切相关，IGF-1受体的高表达与化疗耐药及不良预后相关[19]。本研究中通过干扰IGFBP2，IGFBP3，观察其对卵巢癌耐药性的影响，结果发现，干扰IGFBP2，IGFBP3后，卵巢癌细胞SKOV3对顺铂的敏感性明显增强。因此，卵巢癌细胞的耐药性可能与IGFBP2、IGFBP3的异常表达有关。

在正常细胞向癌细胞转化的过程中,胰岛素样生长因子家族各组成分存在着性质和数量的变化表明胰岛素样生长因子家族在正常细胞增生和恶性转化过程中起着重要作用。而在胰岛素样生长因子结合蛋白家族中，IGFBP3 含量最高，其次为 IGFBP2。因此，通过研究 IGFBP2，IGFBP3在卵巢肿瘤组织中的表达与肿瘤侵袭、迁移的相关性，从而探讨 IGFBP2，IGFBP3在卵巢癌发病及发展、耐药可能的作用机制，进而为卵巢癌的预防、早期诊断及治疗提供理论依据。

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Effects of IGFBP2 and IGFBP3 expression in ovarian tumors on migration, invasion of ovarian cancer

LI Jun,LIU En-ling*,YANG Li

(Obstetrics Department,Tangshan City workers′ Hospital, Tangshan 063000,China)

Objective To study the effect on ovarian tumor migration invasion after inhibition the expression of IGFBP2, IGFBP3.Methods siRAN interference IGFBP2, IGFBP3 expression in ovarian cancer cell lines SKOV3, SKOV3 proliferation detected by CCK-8 kits,SKOV3 apoptosis detected by flow cytometry,SKOV3 migration and invasion detected by transwell experiment and scratched cell healing detection; CCK-8 method detected survival after treated different concentrations of cisplatin (5, 10, 15, 20 ug/mL). Results The proliferation ability of SKOV3 dropped and apoptosis increased after treated siRAN IGFBP2, IGFBP3 compared with the control group , migration and invasion function decline, resistance level to improve greatly. Conclusions The expression of IGFBP2, IGFBP3 in ovarian cancer affected migration and invasion.

IGFBP-2;IGFBP-3;Ovarian;Cancer

2014年河北省医学科学研究重点课题(ZD20140384)。

李君(1980-)，女，硕士研究生，研究方向：产科基础及临床方面研究。E-mail: lijun135579@sina.com

刘恩令(1966-)，男， 博士，主任医师， 研究方向：卵巢癌耐药的研究。E-mail: enling111@sina.com

研究报告

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0032-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.007

2016-06-30