加味逍遥片的薄层色谱研究

张雅丽，张 磊，孙 巍，叶正良

(1.天津中医药大学中药学院，天津 300193； 2.天士力制药集团股份有限公司国际产业中心，天津 300402； 3.天士力控股集团有限公司，天津 300402)

加味逍遥片的薄层色谱研究

张雅丽1*，张 磊2，孙 巍2，叶正良3#

(1.天津中医药大学中药学院，天津 300193； 2.天士力制药集团股份有限公司国际产业中心，天津 300402； 3.天士力控股集团有限公司，天津 300402)

目的：建立鉴别加味逍遥片中8种有效成分的薄层色谱方法。方法：以柴胡皂苷b2、藁本内酯、芍药苷、白术内酯Ⅲ、栀子苷、甘草苷、6-姜辣素和丹皮酚为指标性成分，分别对加味逍遥提取物和加味逍遥片进行薄层色谱鉴别。结果：薄层色谱法可鉴别出柴胡皂苷b2、藁本内酯、芍药苷、白术内酯Ⅲ、栀子苷、甘草苷、6-姜辣素和丹皮酚。结论：该方法操作简便、准确可靠，克服了原方法的不足，可用于加味逍遥片的质量控制。

加味逍遥片； 柴胡皂苷b2； 藁本内酯； 芍药苷； 白术内酯Ⅲ； 栀子苷； 甘草苷； 6-姜辣素； 丹皮酚； 薄层鉴别

薄层色谱法是中药材定性鉴别[1-3]、产地分析[4-6]、中药成方制剂质量标准[7-10]主要的研究和控制手段之一，因而在中药分析与检验中占有重要的地位[11-12]。中药复方因组方药材众多、化学成分复杂，现有方法只有其中部分药材的薄层鉴别方法，且操作繁琐，无法全面控制复方质量。欧洲药品管理局发布的指导性文件[13-14]明确表示对中药复方的控制应基于质量控制的原则，能够鉴别出复方制剂中的已知中药物质，若某些中药物质不能被鉴别，则在制备过程中应当进行控制。加味逍遥源自宋代《太平惠民局方》中的逍遥散，后加入牡丹皮、栀子成方，主要有疏肝清热、健脾养血的功效，临床上常用于治疗肝郁血虚、肝脾不和、两胁胀痛、头晕目眩、倦怠食少、月经不调、脐腹胀痛等症状[15]。因其疗效显著、剂型多样，故本研究参照《中华人民共和国药典·一部》(2015年版)，制备加味逍遥提取物及加味逍遥片，建立加味逍遥提取物及加味逍遥片中所含有的10味中药材(甘草、白芍、柴胡、栀子、当归、牡丹皮、干姜、薄荷、白术、茯苓)的薄层色谱鉴别方法，为加味逍遥片质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

薄层色谱全自动点样仪(ATS 4型，瑞士CAMAG 公司)；薄层色谱摄像仪(Reperostar 3型，瑞士CAMAG公司)；薄层色谱视频摄像系统(Videostore system，瑞士CAMAG公司)；薄层色谱软件(Win CAT，瑞士CAMAG公司)；SB25-12DTD型超声波清洗器(宁波新芝生物科技有限公司)；Sartorius BS210S型分析天平(万分之一)；双槽展开缸(上海信宜仪器厂)；硅胶G板200 mm×100 mm(青岛海洋化工厂)。

1.2 药品与试剂

对照品柴胡皂苷b2、藁本内酯、芍药苷、白术内酯Ⅲ、栀子苷、甘草苷、6-姜辣素和丹皮酚均购自中国食品药品检定研究院，纯度均>98%；所用试剂均为分析纯；加味逍遥提取物及加味逍遥片均为实验室自制。

2 方法与结果

2.1 柴胡、白芍、栀子、甘草的定性鉴别

2.1.1 加味逍遥提取物供试品的制备：称取加味逍遥提取物6 g，置100 ml离心管中，加入纯化水20 ml，用玻璃棒搅拌使溶解，离心8 min(转速3 000 r/min)，取上清液，加至约10 ml的D101大孔吸附树脂柱(大孔吸附树脂已用乙醇浸泡24 h以上，放入玻璃柱后用10倍纯化水冲洗至无醇味)，用2%氢氧化钠溶液10 ml洗脱，水洗至流出液为无色，用70%甲醇20 ml洗脱，洗脱液弃去。后用无水甲醇洗脱20 ml，收集该流出液，蒸干，残渣用甲醇溶解定容，置 5 ml容量瓶，摇匀，即得。

2.1.2 加味逍遥片供试品的制备：取加味逍遥片适量，研细，称取本品6 g，置100 ml离心管中，加入纯化水20 ml，用玻璃棒搅拌使溶解，离心8 min(转速3 000 r/min)，取上清液，加至约10ml的D101大孔吸附树脂柱，用2%氢氧化钠溶液10 ml洗脱，水洗至流出液为无色，用70%甲醇20 ml洗脱，洗脱液弃去。后用无水甲醇洗脱20 ml，收集该流出液，蒸干，残渣用甲醇溶解定容，置5 ml容量瓶，摇匀，即得。

2.1.3 对照品溶液的制备：取甘草苷、芍药苷、栀子苷、柴胡皂苷b2对照品适量，精密称量，加甲醇分别配制成1 mg含0.5 mg/ml的溶液，摇匀，即得。

2.1.4 薄层色谱法：分别吸取加味逍遥提取物供试品、加味逍遥片供试品各20 μl及对照品溶液10 μl，点于同一硅胶G薄层板上(100 mm×200 mm)，置于乙酸乙酯-甲醇-氨水(V∶V∶V=6 ∶2 ∶1.2)展开剂中展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果表明，加味逍遥提取物供试品、加味逍遥片供试品与对照品溶液在相应位置上显相同颜色的斑点，见图1。

1.甘草苷对照品；2.芍药苷对照品；3—5.加味逍遥提取物供试品；6—8.加味逍遥片供试品；9.柴胡皂苷对照品； 10.栀子苷对照品1. reference substance of liquiritin; 2. reference substance of paeoniflorin; 3—5.test sample of Jiaweixiaoyao extractive; 6—8.test sample of Jiaweixiaoyao tablets; 9. reference substance of saikoside; 10.reference substance of gardenoside图1 柴胡、白芍、栀子、甘草的薄层色谱图Fig 1 TLC chromatograms of Bupleuri Radix,Paeoniae Radix Alba,Gardeniae Fructus and Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma

2.2 干姜的定性鉴别

2.2.1 加味逍遥提取物供试品的制备：称取加味逍遥提取物6 g，置150 ml平底烧瓶中，加石油醚(60～90 ℃)100 ml，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液减压旋转蒸干，残渣加甲醇0.5 ml溶解，即得。

2.2.2 加味逍遥片供试品的制备：取加味逍遥片适量，研细，称取6 g，置150 ml平底烧瓶中，加石油醚(60～90 ℃)100 ml，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液减压旋转蒸干，残渣加甲醇0.5 ml溶解，即得。

2.2.3 对照品溶液的制备：取6-姜辣素对照品适量，精密量取，加甲醇配制成1 mg/ml的对照品溶液。

2.2.4 阴性加味逍遥提取物对照品的制备：取未加干姜提取出的加味逍遥提取物，按“2.2.1”项下方法制备，即得。

2.2.5 阴性加味逍遥片对照品的制备：取未加干姜制成的加味逍遥片，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.2.6 薄层色谱法：分别吸取加味逍遥提取物供试品、加味逍遥片供试品、阴性加味逍遥提取物对照品、阴性加味逍遥片对照品各20 μl及对照品溶液2 μl，点于同一薄层板上，置于环己烷-乙醚(V∶V=1∶3)的展开剂中进行展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，见图2。结果表明，加味逍遥提取物供试品、加味逍遥片供试品在对照品溶液的相应位置上显相同颜色的斑点。

1.6-姜辣素对照品；2.加味逍遥提取物供试品；3.加味逍遥片供试品；4.阴性加味逍遥提取物对照品；5.阴性加味逍遥片对照品1.reference substance of 6-gingerol; 2.test sample of Jiaweixiaoyao extractive; 3.test sample of Jiaweixiaoyao tablets; 4.negative reference substance of Jiaweixiaoyao extractive; 5.negative reference substance of Jiaweixiaoyao tablets图2 干姜的薄层色谱图Fig 2 TLC chromatograms of Zingiberis Rhizoma

2.3 白术的定性鉴别

因加味逍遥片中未检出白术内酯Ⅲ，故只在提取物中进行鉴别。

2.3.1 供试品溶液的制备：取加味逍遥提取物10 g，加适量硅藻土充分研磨，研至提取物干燥，将混合物置锥形瓶中，加石油醚(30～60 ℃)50 ml，超声处理20 min，滤过，滤液备用，再加入石油醚(30～60 ℃)50 ml，超声处理20 min，滤过，合并2次滤液，减压旋转蒸干，残渣加乙酸乙酯1 ml使溶解，作为供试品溶液。

2.3.2 对照品溶液的制备：取适量白术内酯Ⅲ对照品，用乙酸乙酯溶解，制备1 mg/ml的对照品溶液。

2.3.3 阴性对照品溶液的制备：取未加白术的加味逍遥提取物，按照“2.3.1”项下方法制备，即得。

2.3.4 薄层色谱法：分别吸取供试品溶液、阴性对照品溶液10 μl、对照品溶液3 μl，点于同一薄层板上，以(1)环己烷-乙酸乙酯(V∶V=50 ∶1)为展开剂，预饱和20 min后上行展开8 cm，取出，晾干，继续用(2)石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(V∶V=3.5∶1)为展开剂，预饱和20 min后上行展开5 cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，于365 nm紫外光下检视，见图3。

1.供试品；2.对照品溶液；3.阴性对照品溶液1.test sample; 2.reference substance; 3.negative reference substance图3 白术的薄层色谱图Fig 3 TLC chromatograms of Atractylodis Macrocephalae Rhizoma

2.4 当归和牡丹皮的定性鉴别

2.4.1 加味逍遥提取物供试品的制备：称取加味逍遥提取物6 g，置100 ml离心管中，加入50%乙醇溶液50 ml，用玻璃棒搅拌使溶解，超声处理10 min，加入石油醚(60～90 ℃)萃取3次，每次30 ml，合并石油醚萃取液，减压旋转蒸干，残渣加乙酸乙酯2 ml溶解，即得。

2.4.2 加味逍遥片供试品的制备：取加味逍遥片适量，研细，称取4 g，置100 ml离心管中，加入50%乙醇溶液50 ml，用玻璃棒搅拌使溶解，超声处理10 min，加入石油醚(60～90 ℃)萃取3次，每次30 ml，合并石油醚萃取液，减压旋转蒸干，残渣加乙酸乙酯2 ml溶解，即得。

2.4.3 对照品溶液的制备：取蒿本内酯对照品适量，用乙酸乙酯溶解制成质量浓度为0.4 mg/ml的蒿本内酯对照品溶液。取丹皮酚对照品适量，用乙酸乙酯溶解配制质量浓度为0.5 mg/ml的丹皮酚对照品溶液。

2.4.4 阴性加味逍遥提取物对照品的制备：分别取未加当归的加味逍遥提取物及未加牡丹皮的加味逍遥提取物，按照“2.4.1”项下方法分别制备当归阴性加味逍遥提取物对照品、牡丹皮阴性加味逍遥提取物对照品。

2.4.5 阴性加味逍遥片对照品的制备：分别取未加当归的加味逍遥片及未加牡丹皮的加味逍遥片，按照“2.4.2”项下方法分别制备当归阴性加味逍遥片对照品、牡丹皮阴性加味逍遥片对照品。

2.4.6 当归对照药材的制备：取当归药材适量，粉碎、研细，称取0.2 g，置100 ml离心管中，按照“2.4.2”项下方法制备，即得。

2.4.7 薄层色谱法：分别吸取加味逍遥提取物供试品、加味逍遥片供试品、阴性加味逍遥提取物对照品、阴性加味逍遥片对照品各10 μl、当归药材对照品5 μl及蒿本内酯对照品溶液2 μl、丹皮酚对照品溶液5 μl，分别点于不同薄层板上，分别置于环己烷-乙酸乙酯(V∶V=10 ∶1)展开剂中进行展开，取出，晾干，置365 nm紫外灯下检视。再喷以5%三氯化铁乙醇溶液，至斑点显色清晰，见图4—5。

1.当归阴性加味逍遥提取物对照品；2.当归阴性加味逍遥片对照品；3.加味逍遥提取物供试品；4.加味逍遥片供试品；5.当归对照药材；6.蒿本内酯对照品1.reference substance of Jiaweixiaoyao extractive with negative Angelica；2.reference substance of Jiaweixiaoyao tablets negative Angelica； 3.test sample of Jiaweixiaoyao extractive； 4.test sample of Jiaweixiaoyao tablets；5.reference substance of Angelica； 6.reference substance of ligustilide图4 当归的薄层色谱图Fig 4 TLC chromatograms of Angelicae Sinensis Radix

3 讨论

欧洲植物药应用历史悠久，对植物药复方制剂的质量控制一直走在世界前列，基于其严格的质量控制要求，本实验室曾采用液相方法对加味逍遥提取物和片剂中可能检测到的成分进行梳理[16]，以此作为薄层鉴别部分指标性成分的选择依据。因薄荷药材富含挥发油且薄荷脑在提取物和制剂中不稳定，故不作为定性鉴别的成分，白术内酯Ⅲ仅在提取物中检测到，在制剂中未检出，故只在提取物中建立其薄层鉴别方法。

《中华人民共和国药典：一部》(2015版)加味逍遥丸的鉴别项下，仅有对组方中的当归、牡丹皮、柴胡、白术、栀子 5 味药材的薄层鉴别方法，在加味逍遥口服液(合剂)鉴别项下仅有对当归、牡丹皮、栀子、甘草 4味药材的薄层鉴别方法。无论是加味逍遥丸还是加味逍遥口服液(合剂)，作为由9味/10味药材组成的中药大复方，其定性鉴别项下只对复方中的部分药材进行控制，显然无法全面控制其质量，本研究首次对加味逍遥提取物及其片剂中的8种活性成分建立薄层色谱鉴别方法，有助于复方制剂质量的全面控制。

加味逍遥丸薄层鉴别方法对方中柴胡和栀子采用了不同的方法，操作较为繁琐且耗时，本研究首次建立了柴胡、白芍、栀子、甘草4味药材同时鉴别的方法，分别以柴胡皂苷b2、芍药苷、栀子苷、甘草苷作为指标性成分，对加味逍遥提取物及制剂进行定性鉴别，该方法操作简便、设备简单、成本相对低廉、能够实现组方中4味药材的快速鉴别。

加味逍遥口服液(合剂)的鉴别方法中，已有对当归、牡丹皮药材的鉴别方法，但按照该方法未能对加味逍遥提取物及其制剂中的当归及牡丹皮进行有效鉴别。故本研究从优化提取效率、降低试剂毒性、保证检测灵敏度等角度出发，优化了加味逍遥提取物及其制剂的供试品溶液制备方法，并且探讨了不同展开剂、点样量、硅胶板对展开结果的影响。最终在供试品溶液的制备过程中，增加了50%乙醇的提取步骤，同时将取样量增加至6 g，并将易制毒的乙醚改为石油醚(60～90 ℃)进行萃取，萃取次数由2次改为3次，使得供试品溶液中的蒿本内酯和丹皮酚均能被有效鉴别。加味逍遥片供试品溶液的点样量为10 μl时，蒿本内酯及丹皮酚斑点拖尾变形，推测原因为加味逍遥片中辅料的干扰，薄层板过载。因而，降低取样量，由6 g改为4 g，重新制备加味逍遥片供试品溶液，进行供试品溶液与点样量的考察。结果表明，优化供试品溶液制备方法后，且点样量为10 μl时，蒿本内酯及丹皮酚斑点清晰，无斑点拖尾及变形现象。

原方法中，加味逍遥丸已存在白术药材鉴别方法，按照该方法对加味逍遥提取物及其制剂中的白术进行鉴别，结果显示，白术药材的薄层色谱与白术内酯Ⅲ对照品在相同的位置上未出现相同颜色的斑点，加味逍遥提取物及其制剂的薄层色谱与白术药材在相同位置上仅出现一个相同颜色的斑点。但不能确定此斑点为白术药材中的有效成分。因此，参考相关文献[17]，本研究对展开剂、展开方式、检视方法等条件进行优化，并且增加样品的取样量及提取次数，同时用硅藻土研磨吸收水分后重新制备加味逍遥提取物及其制剂的供试品溶液，进行白术的薄层色谱鉴别。本研究条件下，白术药材的薄层色谱与白术内酯Ⅲ对照品在相同位置上显相同颜色的斑点，可确定加味逍遥提取物及其制剂的白术鉴别参照物为白术内酯Ⅲ。而称样量10～30 g、薄层点样量20～50 μl时，均未能对加味逍遥片供试品溶液中的白术内酯Ⅲ进行有效鉴别，推测在加味逍遥片在制备过程中，由于温度、光照等原因，导致白术内酯Ⅲ分解，故不再进行片剂的白术薄层鉴别。

参考《中华人民共和国药典:一部》(2015年版)中小建中颗粒、通天口服液、小儿感冒口服液的质量控制方法，对加味逍遥提取物及其制剂中的干姜进行薄层鉴别。在该实验条件下，干姜药材的薄层色谱与6-姜辣素对照品在相应位置上显相同颜色的斑点，可确定加味逍遥提取物及加味逍遥片中的的干姜鉴别参照物为6-姜辣素，其斑点清晰可见，但斑点的Rf在0.2左右。因此，本研究对展开剂及点样量进行优化，结果表明采用环己烷-乙醚(V∶V=1 ∶2)或环己烷-乙醚(V∶V=1 ∶3)为展开剂，加味逍遥提取物供试品溶液的点样量为20 μl、加味逍遥片供试品溶液的点样量为10 μl时，加味逍遥提取物供试品溶液及加味逍遥片供试品溶液中的6-姜辣素斑点清晰可见，无拖尾变形，且Rf在0.5左右，能够对干姜进行有效鉴别。

本研究对加味逍遥提取物及加味逍遥片中的8种活性成分进行薄层鉴别研究，进一步完善了加味逍遥方的质量控制标准，为中药复方的定性鉴别研究提供了参考依据，也为《中华人民共和国药典》提供了更全面的成方制剂及制剂中间体质量控制研究的方法和思路。

[1]胡婧，易凡力，刘松青.十五味黑药丸中4种活性成分的定性鉴别及胡椒碱的含量测定[J].第三军医大学学报，2011，33(6)：621-624.

[2]李伟，黎先春，王小如.丹参药材物质群薄层色谱指纹特征的提取与表达[J].世界科学技术，2003，5(1)：58-61.

[3]叶志龙，高明，黄玉梅，等.鹿茸岭南特色饮片HPLC指纹图谱及薄层色谱的研究分析[J].中药材，2014，37(6)：945-948.

[4]关明，王凤琳，陈坚.不同地理居群大蒜药材高效薄层色谱指纹图谱研究[J].药物分析杂志，2011，31(10)：1924-1929.

[5]高晓霞，严寒静，梁从庆.不同采集地制何首乌薄层色谱指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志，2007，13(5)：4-7.

[6]顾志荣，陈晖，王亚丽，等.不同生长环境当归药材薄层色谱鉴别研究[J].时珍国医国药，2014，25(9)：2164-2166.

[7]吴笛，王德勤，李楚源.复方丹参片薄层色谱鉴别方法研究[J].药物分析杂志，2012，32(9)：1658-1660.

[8]耿帅，赵育林，曾凯，等.丹皮酚的研究进展[J].中国新药与临床杂志，2016，35(5)：310-313.

[9]刘元瑞，葛海生，赵康虎，等.制备薄层色谱联合FTIR检测中药制剂中添加化学药品方法的研究[J].中国药学杂志，2009，44(24)：1924-1927.

[10] 巩伟，孙旭，赵庆华，等.板蓝根配方颗粒的质量标准研究[J].中国药房，2015，26(18)：2541-2544.

[11] 罗由萍，邓鹏飞.薄层色谱及其在药用植物研究中的应用[J].安徽农业科学，2011，39(6)：3309-3312.

[12] 李向军，王超，王永,等.中药薄层色谱影响因素分析及应用[J].中国药业，2011，20(14)：13-15.

[13] European Medicines Agency.Guideline on Quality of Combination Herbal Medicinal Products/Traditional Herbal Medicinal Products[S].[2007-07-26].http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500003298.pdf.

[14] European Medicines Agency.Guideline on Specifications:Test Procedures and Acceptance Criteria for Herbal Substances, Herbal Preparations and Herbal Medicinal Products/Traditional Herbal Products[S].[2006-03-30].http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC50 0003393.pdf.

[15] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：815-816.

[16] 李明月，周立红，章顺楠，等.加味逍遥提取物超高效液相色谱指纹图谱研究[J].药物评价研究，2016，39(2)：230-236.

[17] 寿旦，俞忠明，章建民.改良的白术药材薄层色谱鉴别研究[J].中华中医药学刊，2011,29(3):535-536.

Study on TLC Identification for Jiaweixiaoyao Tablets

ZHANG Yali1, ZHANG Lei2, SUN Wei2, YE Zhengliang3

(1.School of Chinese Materia Medica, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China; 2.International Industry Center, Tasly Pharmaceutical Group Company Limited, Tianjin 300402, China; 3.Tasly Holding Group Company Limited, Tianjin 300402, China)

OBJECTIVE：To establish method of TLC identification for 8 effective components in Jiaweixiaoyao tablets. METHODS: TLC identification of were carried out to identify the extract and tablets of Jiaweixiaoyao tablets through the indicators as saikoside b2, ligustilide, paeoniflorin, atractylenolide Ⅲ, geniposide, liquiritin, 6-gingerol and paeonol. RESULTS: Saikoside b2, ligustilide, paeoniflorin, atractylenolide Ⅲ, geniposide, liquiritin, 6-gingerol and paeonol were identified by TLC identification. CONCLUSIONS: This method is simple, accurate and reliable, which can over come deficiencies of the original method and can be used for the quality control of Jiaweixiaoyao tablets.

Jiaweixiaoyao tablets; Saikoside b2; Ligustilide; Paeoniflorin; Atractylenolide Ⅲ; Geniposide; Liquiritin; 6-gingerol; Paeonol; TLC identification

R927

A

1672-2124(2017)01-0084-04

2016-08-08)

*硕士。研究方向：中药学和药物分析。E-mail：dophiner5@sina.com

#通信作者：研究员。研究方向：中药质量控制与新药开发。E-mail：yezl@tasly.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.01.031