低氧对大鼠视网膜Müller细胞低氧诱导因子1α和促红细胞生成素蛋白表达的影响

曲 虹 厉 泉

(千佛山医院，山东 济南 250014)

低氧对大鼠视网膜Müller细胞低氧诱导因子1α和促红细胞生成素蛋白表达的影响

曲 虹 厉 泉

(千佛山医院，山东 济南 250014)

目的 探讨低氧对大鼠视网膜Müller细胞低氧诱导因子(HIF)-1α和促红细胞生成素(EPO)蛋白表达的影响。方法 体外传代培养大鼠视网膜Müller细胞，分为正常对照组(N组)、氯化钴浓度：50,100,150,200,300 μmol/L(C50、C100、C150、C200、C300组)，MTT检测不同浓度氯化钴对Müller细胞活力的影响。免疫细胞化学、细胞免疫荧光检测、Western印迹和酶联免疫吸附试验检测HIF-1α、EPO蛋白表达的情况。结果 氯化钴浓度低于200 μmol/L时，细胞活力不受氯化钴浓度的影响。从200 μmol/L开始，细胞活力随氯化钴浓度增高而下降。氯化钴浓度高于50 μmol/L时，HIF-1α、EPO蛋白免疫染色可见阳性表达。酶联免疫吸附试验检测，从50 μmol/L 开始HIF-1α蛋白的表达随氯化钴浓度升高而增加。Western印迹检测，EPO蛋白表达从50 μmol/L开始增高，在150 μmol/L时达到高峰，以后逐渐下降。结论 低氧可引起细胞活性改变并诱导视网膜Müller细胞HIF-1α和EPO蛋白表达的变化。

低氧诱导因子1α；促红细胞生成素；视网膜；Müller细胞

缺氧性视网膜病变引起神经细胞损伤是视力丧失的重要原因，Müller细胞是视网膜重要的支持营养细胞，对维持视网膜神经功能具有重要意义。研究低氧对视网膜Müller细胞的影响，不仅对缺氧性视网膜病变发病机制有重要意义，同时也为视网膜神经保护提供新的思路。本文探讨低氧对视网膜Müller细胞功能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 新生牛血清，DMEM培养基，胰蛋白酶，乙二胺四乙酸购自Gibco公司，氯化钴购自Sigma公司；抗鼠低氧诱导因子(HIF)-1α、促红细胞生成素(EPO)单克隆抗体来自Santa Cruz公司；WIP细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒为北京博奥森生物技术公司产品；PV6001免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒和FITC标记二抗来自北京中杉生物技术公司。

1.2 视网膜Müller细胞传代培养 出生5～7 d 的标准实验用清洁级Wistar乳鼠(青岛市实验动物和动物实验中心提供),每次5只，75%酒精浸泡处死，剥离视网膜，胰蛋白酶及乙二胺四乙酸消化25 min,过400 目筛网、离心、弃上清，加含血清培养液(10%血清)吹打数次以重悬细胞，调整细胞浓度为5×105/ml,接种于多聚赖氨酸包被过夜的塑料培养瓶内,置于培养箱培养。培养24 h第一次换液，之后每3 d换液1次,7～10 d时细胞融合达80%以1∶2方式进行传代。每天用倒置显微镜对培养细胞的生长过程及形态学的变化，取第3代细胞为实验对象〔1〕。

1.3 实验分组 N组(正常对照组)：DMEM培养基培养。氯化钴(C)50，C100，C150，C200，C300组：第3代Müller细胞培养5 d，换含氯化钴(氯化钴终浓度分别为50，100，150，200，300 μmol/L)的培养液培养24 h。

1.4 免疫细胞化学、细胞免疫荧光(FITC标记)染色 实验细胞以每孔2×104个/ml的密度接种于孔内预置1 cm2盖玻片的24孔板中，终止培养时吸出培养液，多聚甲醛固定后取出盖玻片置于载玻片上。按照试剂盒实验步骤操作,分别滴加0.1%TritonX-100、0.3%H2O2、山羊血清、一抗(抗大鼠EPO抗体1∶100，孵育2 h)、二抗(孵育20 min)，DAB显色，脱水，透明，封片。细胞免疫荧光(FITC标记)染色检测HIF-1α蛋白：一抗为抗大鼠HIF-1α抗体，二抗为羊抗兔FITC荧光标记(1∶50)，以缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察照相。

1.5 MTT细胞活性检测 96孔培养板接种细胞密度2×104/ml，常规设5个复孔，并设立空白调零。培养液冲洗后每孔加入100 μl MTT溶液(0.5 mg/ml)，温育4 h后翻板弃去MTT溶液，每孔加200 μl二甲基亚砜，酶标仪570 nm波长处测各孔吸光度值(A值)。MTT被活细胞摄取后经线粒体代谢生成甲臜，线粒体活力越旺盛，甲臜生成越多，吸光度也越高。

1.6 Western印迹检测EPO蛋白的表达 每25 cm2培养瓶加WIP细胞裂解液500 μl提取蛋白，测定蛋白浓度。常规电泳(每孔加样20 μl，2 μg/μl)、转膜、封闭，分别加入抗大鼠EPO、β-actin抗体(1∶200)、辣根过氧化酶标记二抗(1∶600)孵育，DAB显色、扫描，Bandscan5.0定量分析，结果均用β-actin灰度值校正。

1.7 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HIF-1α蛋白表达 每25 cm2培养瓶加WIP细胞裂解液500 μl提取蛋白，测定并调节各组标本蛋白质浓度为5 μg/ml；试验设复孔6个，并设立空白对照孔和阴性对照孔。待测标本包被聚苯乙烯包被板。每孔加入100 μl样品，置湿盒4℃过夜，封闭液封闭；每孔加入100 μl洗涤液稀释的HIF-1α抗体反应1 h；洗涤扣干；每孔加入100 μl 1∶1 000 HRP标记二抗反应1 h；显色：上述每孔中加入临时配制的底物溶液100 μl，室温避光反应20 min，每孔加入50 μl 终止液终止反应，λ=495测定吸光度A值。

1.8 统计学方法 采用SPSS11.0统计学软件进行单因素方差分析,q检验。

2 结 果

2.1 视网膜Müller细胞体外培养 传至第3代时细胞稳定，呈现较一致的细胞形态，细胞扁平，细胞体积大，细胞核清晰，核仁明显，胞质丰富，折光暗，可见粗大突起，呈镶嵌样排列，细胞分界不清。见图1。

图1 第3代的视网膜Müller细胞(×200)

2.2 MTT检测结果 N组、C50、C100、C150组间两两比较A值差异无统计学意义(N组：0.82±0.03、C50组：0.81±0.02、C100组：0.81±0.01、C150组：0.80±0.01；P>0.05)。C200组(0.65±0.03)较N组、C50、C100、C150组明显降低(P<0.01)。C300组A值低于C200组(C300组：0.55±0.02，q=14.07，P<0.01)。

2.3 免疫细胞化学和细胞免疫荧光检测 免疫细胞化学染色检测：N组无EPO蛋白阳性染色，C50组可见蛋白阳性表达呈黄色着染，C150组呈棕黄色着染，见图2；细胞免疫荧光染色：N组无HIF-1α蛋白阳性表达，氯化钴浓度>50 μmol/L 各组均呈绿色阳性荧光染色，见图3。

图2 视网膜Müller细胞EPO阳性表达(DAB，×400)

图3 细胞免疫荧光染色HIF-1α蛋白表达(FITC标记，×400)

2.4 HIF-1α蛋白表达 C50组A值高于N 组(C50组：0.13±0.01，N组：0.04±0.01；q=15.55，P<0.01)。C50、C100、C150、C200、C300各组HIF-1α蛋白表达随着氯化钴浓度的升高而增加(C100组：0.32±0.01、C150组：0.45±0.01、C200组：0.64±0.03、C300组：0.79±0.02；q=30.53，21.37，31.92，25.26；P<0.01)。

2.5 EPO蛋白表达 C50组蛋白表达高于N组(C50组：0.22±0.01，N组：0.10±0.01；q=17.68，P<0.01)，C50、C100、C150组蛋白表达随氯化钴浓度升高而增加，C150组蛋白表达到最高峰。C200组蛋白表达低于C150组(C200组：0.52±0.02，C150组：0.63±0.02，q=15.39；P<0.01)，C200、C300组蛋白表达随氯化钴浓度升高而下降(C300组：0.33±0.02，q=29.46；P<0.01)，但仍均高于N组(P<0.01)。见图4。

1～6：N组、C50、C100、C150、C200、C300组图4 Western印迹法检测EPO蛋白的表达

3 讨 论

视网膜组织是对氧非常敏感的神经组织，许多视网膜病变均是由急性或慢性缺血缺氧所致。缺氧性视网膜病变除了引起视网膜血管的改变以外，其病变的主要特征是视网膜神经元的损伤、变性、凋亡，最终导致视力的丧失。Müller细胞是存在于视网膜中的神经胶质细胞，对神经元正常功能的维持、损伤修复、“血-视网膜屏障”形成、 神经信号传递均具有重要作用。此外，Müller细胞在缺血缺氧性视网膜病变中也起着重要作用，可分泌多种因子，影响视网膜代谢，参与神经细胞损伤过程〔2,3〕。缺氧性视网膜病变的研究以往多集中在视网膜神经元的改变上，对于低氧对Müller细胞的影响研究甚少。通过观察低氧培养下Müller细胞功能的改变，可揭示Müller细胞在缺氧性视网膜病变发病机制中的作用。氯化钴是钴的重要化合物，钴在高浓度时与氧结合，可阻断氧感受器与氧结合，使细胞在不缺氧的环境下“感觉”缺氧，并发生与低氧相似的一系列反应。利用钴离子这一特性，CoCl2通常被用来在细胞培养模拟缺氧环境〔4〕。本研究显示氯化钴在200 μmol/L浓度以下时，细胞活力无改变，而200 μmol/L及以其上浓度就可引起细胞活力的下降，即为细胞损伤的表现，并且呈一定的浓度依赖性。

低氧预适应是机体对抗损伤的一种重要内源性保护机制。研究表明心脑等组织存在着低氧预适应现象，细胞感受低氧刺激可改变有关基因的表达，以提高细胞对损伤的耐受力〔5,6〕。脑低氧预适应可提高脑神经细胞HIF-1α及其下游基因的表达，这些基因可使细胞防御功能增强，保护细胞免受进一步的损伤，并把这些基因称之为低氧相关基因，这些基因包括HIF-1以及HIF-1下游的EPO等靶基因。本文结果显示氯化钴引起的化学性低氧可诱导视网膜Müller细胞HIF-1α蛋白的表达。常氧条件下细胞内生成的HIF-1α很快降解，此时虽有mRNA表达但却检测不到蛋白。低氧时，HIF-1α生成增加，同时HIF-1α降解过程也受到抑制，所以HIF-1α蛋白的表达水平就明显增加〔7〕。本文显示氯化钴模拟的低氧可以诱导视网膜Müller细胞EPO蛋白的表达增加，并且在适度的浓度(150 μmol/L)下有最高的表达。HIF-1α随着氯化钴浓度升高而增加，而EPO在150 μmol/L浓度时达到高峰后出现了下降。

在以往研究成果的基础上，我们分析了低氧诱导视网膜Müller细胞HIF-1α、EPO蛋白如此表达的原因。HIF-1是有双重作用的因子，在一定条件下，HIF-1可产生抗凋亡的保护作用，但是超过一定的量，就会发挥促凋亡和促新生血管的作用。在200 μmol/L浓度以下,氯化钴对Müller细胞无损害，并能诱导HIF-1α、EPO蛋白表达增加，以往研究发现，视网膜感光细胞和神经节细胞均有EPO受体，此低氧条件下产生的HIF-1α、EPO 蛋白发挥其对细胞的保护作用，即产生低氧预适应的作用〔8〕。在200 μmol/L浓度以上时，Müller细胞出现了细胞活力下降的损害改变，出现了低氧损伤。此时HIF-1α蛋白表达随氯化钴浓度升高继续增加，在这种情况下，可能主要发挥HIF-1α蛋白的促凋亡作用和促新生血管增生的作用，而不是抗凋亡的保护作用〔9〕。本文结果显示一定程度的低氧可引起视网膜Müller细胞内源性保护反应，并可能通过HIF-1α、EPO蛋白的表达来参与视网膜神经元的保护。

1 曲 虹，牛膺筠，党光福.高浓度葡萄糖对视网膜Müller细胞超微结构和低氧诱导因子-1α表达的影响〔J〕.中国老年学杂志,2007;27(7):3531-3.

2 Yu J,Zhong Y,Cheng Y,etal.Effect of high hydrostatic pressure on the expression of glutamine synthetase in rat retinal Müller cells cultured in vitro〔J〕.Exp Ther Med，2011;2(3):513-6.

3 Zheng Y,Zeng H,She H,etal.Expression of peptide NAP in rat retinal Müller cells prevents hypoxia-induced retinal injuries and promotes retinal neurons growth〔J〕.Biomed Pharmacother,2010;64(6):417-23.

4 Jin W,Wang J,Xu S,etal.Radioprotective effect on HepG2 cells of low concentrations of cobalt chloride:induction of hypoxia-inducible factor-1 alpha and clearance of reactive oxygen species〔J〕.J Radiat Res,2013;54(2):203-9.

5 Yang L,Fan M,Du F,etal.Hypoxic preconditioning increases iron transport rate in astrocytes〔J〕.Biochim Biophys Acta,2012;1822(4):500-8.

6 Park HK,Seol IJ,Kim KS.Protective effect of hypoxic preconditioning on hypoxic-ischemic injured newborn rats〔J〕.J Korean Med Sci,2011;26(11):1495-500.

7 Vadlapatla RK,Vadlapudi AD,Mitra AK.Hypoxia-inducible factor-1(HIF-1):a potential target for intervention in ocular neovascular diseases〔J〕.Curr Drug Targets,2013;14(8):919-35.

8 Giusti S,Fiszer de Plazas S.Neuroprotection by hypoxic preconditioning involves upregulation of hypoxia-inducible factor-1 in a prenatal model of acute hypoxia〔J〕.J Neurosci Res,2012;90(2):468-78.

9 Mc Laren AT,Marsden PA,Mazer CD,etal.Increased expression of HIF-1alpha,nNOS and VEGF in the cerebral cortex of anemic rats〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2007;292(1):403-14.

〔2013-08-28修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

山东省自然科学基金(ZR2011HL057；ZR2013HM028)

曲 虹(1973-)，女，博士，副主任医师，主要从事玻璃体视网膜病变研究。

R774

A

1005-9202(2017)01-0029-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.012