半胱氨酰白三烯受体1在胰腺癌组织中的表达及临床意义

孟 艳， 朱 莹, 张亚庆, 邹凌云, 张秋楠

(1 葫芦岛市中心医院龙湾院区 急诊科， 辽宁 葫芦岛125001；2 葫芦岛市中心医院 消化科， 辽宁 葫芦岛125001)

半胱氨酰白三烯受体1在胰腺癌组织中的表达及临床意义

孟 艳1， 朱 莹2, 张亚庆2, 邹凌云2, 张秋楠2

(1 葫芦岛市中心医院龙湾院区 急诊科， 辽宁 葫芦岛125001；2 葫芦岛市中心医院 消化科， 辽宁 葫芦岛125001)

目的 探讨半胱氨酰白三烯受体(CysLTR)1在胰腺癌组织中的表达及其与临床特征和预后的关系。方法 选取2015年1月-10月葫芦岛中心医院收治的病理确诊为胰腺癌的患者42例，收集癌组织及癌旁组织，采用real-time PCR检测组织CysLTR-1 mRNA相对表达量，并对患者随访1年。计量资料两组间比较采用t检验；多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。胰腺癌患者预后的影响因素采用多因素logistic回归分析。结果 癌组织中CysLTR-1 mRNA相对表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义(0.037 1±0.020 5 vs 0.016 8±0.011 4，t=6.58，P<0.001)；CysLTR-1 mRNA相对表达量与患者的TNM分期(t=2.731，P=0.009)、分化程度(F=10.537，P<0.001)和淋巴结转移相关(t=3.408，P=0.002)。随访期内死亡17例，存活25例；死亡患者CysLTR-1 mRNA相对表达量高于存活患者(0.045 6±0.021 7 vs 0.031 3±0.019 8)，差异有统计学意义(t=2.21，P=0.03)。logistic回归分析显示，TNM分期[比值比(OR)=6.92，95%可信区间(95%CI)：1.30～36.82，P=0.02]、分化程度(OR=5.71，95%CI：1.44～22.62，P=0.01)以及淋巴结转移(OR=9.62，95%CI：2.23～41.46，P<0.001)是影响胰腺癌预后的危险因素；控制患者年龄、性别、TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤发生部位及淋巴结转移等因素后，CysLTR-1 mRNA表达量仍是影响患者预后的危险因素(OR=1.11，95%CI：1.07～1.15，P=0.03)。结论 CysLTR-1参与胰腺癌的发生、发展过程，可作为判断胰腺癌预后的分子标志物。

胰腺肿瘤； 受体， 白三烯； 肿瘤标记， 生物学

胰腺癌发病率在世界范围内逐年升高。全球疾病负担调查显示，从1990年到2013年，胰腺癌死亡率从18.6/10万增加至35.2/10万，死亡率上升47%[1]。我国胰腺癌2015年发病率为9/10万，死亡率高达7.9/10万[2]。由于胰腺癌发病隐匿，病情进展迅速，5年生存率不足5%[3]。胰腺癌的病因及发病机制尚不明确，但研究[4]证实炎症在胰腺癌的发生发展过程中起着重要的作用。半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotriene，CysLT)与其G蛋白偶联受体共同参与炎症反应，现已有研究[5-6]证实半胱氨酰白三烯受体(cysteinyl lenkotriene receptor，CysLTR)1在乳腺癌及大肠癌组织中表达上调，但国内目前尚无CysLTR-1在胰腺癌组织中表达的相关报道。故本研究探讨胰腺癌组织中CysLTR-1 mRNA的表达及其与临床特征和预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2015年1月-10月于葫芦岛市中心医院行手术治疗的胰腺癌患者。纳入标准：(1)所有患者术后病理证实为胰腺癌；(2)患者无其他恶性肿瘤病史；(3)术前无放疗、化疗等其他治疗；(4)取得胰腺癌及癌旁组织标本；(5)患者均知情同意。胰腺癌患者经全面检查，若无禁忌证，首选手术治疗(Whipple手术)。能切除者应尽量切除肿瘤及相关淋巴结；不能切除者则行姑息性手术治疗，如胆肠吻合术。所有患者术后均随访，随访截止日期为2016年8月。

1.2 主要仪器 -80 ℃超低温冰箱、NanoDrop 2000分光光度计、紫外凝胶成像分析仪、超速冷冻台式离心机、普通PCR扩增仪、GeneAmp PCR System9700扩增仪、荧光定量Roche LC480 PCR仪、电泳槽、移液器、电泳仪、离心管、电子分析天平等。

1.3 主要试剂 总RNA提取试剂盒、Real-time PCR试剂盒、PCR引物、琼脂糖、焦炭酸二乙酯、溴化乙锭、DNA ladder marker、蒸馏水、无水乙醇、液氮、异丙醇等。

1.4 研究方法

1.4.1 总RNA提取 从-80 ℃超低温冰箱取出20 mg癌组织及癌旁组织，按照总RNA提取试剂盒说明书进行操作，并加入少量焦炭酸二乙酯进行溶解。

1.4.2 RNA纯度及浓度测定 取上述1 μl热变性总RNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳方法测定RNA完整性，对有DNA污染的RNA采用DNaseⅠ进行相应处理。取1 μl上述总RNA，采用分光光度计测定光密度(OD)值，即OD160/OD280，比值为1.8～2.0提示RNA无降解，同时测定RNA浓度，并进行浓度调制。

1.4.3 逆转录cDNA合成 所有步骤均按照real-time PCR试剂盒说明书进行操作。(1)去除基因组DNA反应：冰上配置10 μl A反应体系(总RNA、gDNA Eraser、Buffer和RNase Free dH2O)，置于普通PCR扩增仪，42 ℃，2 min。(2)逆转录反应：冰上配置10 μl B反应体系(RT Primer MixⅠ、Buffer、PrimeScriptRT Enzyme MixⅠ和RNase Free dH2O)，混合反应体系A和B，置于基因扩增仪，37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。(3)CysLTR-1及内参GAPDH引物：上海Invitrogen公司完成引物的设计及合成。CysLTR-1上游引物：5′-GCACCATTGCTTTGTATCTCAACC-3′，下游引物：5′-ATACCTAACGACACATACCAACC-3′，扩增基因145 bp。内参GAPDH上游引物：5′-GCTCCTCTATGTATGTCGTGA-3′，下游引物为5′-ACCTCCGGCCATGGTGTCTGA-3′，扩增基因80 bp。(4)PCR扩增：配置20 μl反应体系(cDNA、dNTP、Buffer、上下游引物、Tag DNA聚合酶和双氧水)。CysLTR-1 PCR反应温度：预热95 ℃、变性95 ℃、退火60 ℃、延伸72 ℃和4 ℃，反应时间分别为30 s、10 s、1 min、10 min和30 min，共循环30次。GAPDH内参PCR反应温度：预热95 ℃、变性95 ℃、退火50 ℃、延伸72 ℃和4 ℃，反应时间分别为5 min、30 s、30 s、10 min和30 min，共循环30次。

2 结果

2.1 一般资料 共纳入胰腺癌患者42例，其中男31例，女11例，年龄38～77岁，平均(61.25±13.78)岁。纳入患者中26例肿瘤发生在胰头，14例发生在胰体，2例发生在胰尾。随访期内死亡17例，存活25例，且随访时间均满1年。

2.2 CysLTR-1 mRNA相对表达量的比较 癌旁组织中CysLTR-1 mRNA相对表达量为0.016 8±0.011 4，癌组织中的CysLTR-1 mRNA相对表达量为0.037 1±0.020 5，两组比较差异有统计学意义(t=6.58,P<0.001)。

2.3 CysLTR-1 mRNA相对表达量与临床特征的关系胰腺癌组织CysLTR-1 mRNA相对表达量与TNM分期、分化程度和淋巴结转移相关(P值均<0.05)(表1)。

表1 胰腺癌组织中的CysLTR-1 mRNA相对表达量与临床特征的关系

注：与高分化程度比较，1)P<0.05；与中分化程度比较，2)P<0.05

2.4 CysLTR-1 mRNA相对表达量与生存状态的关系 42例患者随访1年内死亡17例，病死率为40.5%。死亡患者CysLTR-1 mRNA相对表达量为0.045 6±0.021 7，高于生存患者的CysLTR-1 mRNA相对表达量(0.031 3±0.019 8)，差异有统计学意义(t=2.21,P=0.03)。

2.5 影响胰腺癌预后的多因素分析 经logistic回归分析发现，TNM分期、分化程度以及淋巴结转移是影响胰腺癌预后的危险因素(P值均<0.05);控制其他因素后，CysTLR-1 mRNA仍然是影响胰腺癌预后的危险因素(P<0.05)(表2)。

表2 影响胰腺癌预后的logistic回归分析

注：由于高分化无死亡病例，故合并高、中分化

3 讨论

胰腺癌是恶性程度较高的消化道肿瘤，95%的胰腺癌为导管细胞腺癌。外科手术仍是目前治疗胰腺癌的唯一有效方法[7-8]。东北地区胰腺癌标化病死率显著高于华北、华中、华南等地区。胰腺癌的病因及发病机制尚不明确，其发生发展是遗传因素、环境因素以及疾病因素等相互作用的结果。研究[4]发现炎症如胰腺炎、胆管炎等是胰腺癌发生的危险因素。CysLTs是一系列炎症介质，包括LTC4、LTE4和LTD4，由花生四烯酸和5-脂氧合酶途径代谢产生，C-6位上含有半胱氨酸残基及硫酯肽键是他们的共同特点。CysLT通过其特异的G蛋白偶联受体(GysLTR-1、GysLTR-2)共同参与生物学作用，如炎症反应、血管平滑肌反应、免疫反应以及组织修复等。

CysLT及其受体不仅在哮喘、心血管疾病、脑损伤等方面起着重要作用，同时，研究[5-6]发现CysLTR(GysLTR-1)在多种肿瘤中表达上调。早在2002年，国外学者Hennig等[9]检测人胰腺癌组织，发现CysTL的两种受体表达量与正常胰腺组织相比，均显著升高。王欣等[10]通过real-time PCR检测90例乳腺癌组织，发现乳腺癌组织中的CysLTR-1基因表达量显著高于癌旁组织，且与肿瘤大小、TNM分期、组织学类型及淋巴结转移呈正相关；CysLTR-1 mRNA高表达患者的生存率显著低于低表达患者。张世强等[11]采用免疫组化法检测大肠癌组织、癌旁组织和腺瘤性息肉组织，发现CysLTR-1阳性表达率显著高于癌旁组织和腺瘤性息肉，且与肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移和组织学分级有关。

本研究发现胰腺癌组织中CysTLR-1 mRNA相对表达量显著高于癌旁组织，且CysTLR-1 mRNA相对表达量与TNM分期、肿瘤分化程度以及淋巴结转移相关，即TNM分期越高、肿瘤分化程度越低以及有淋巴结转移组织中的CysLTR-1 mRNA相对表达量显著升高。同时对1年内不同存活状态的患者进行比较，发现死亡患者的CysLTR-1 mRNA相对表达量显著高于存活者，提示CysTLR-1能促进肿瘤细胞的增殖和扩散，从而影响患者预后。经多因素分析发现，控制患者年龄、性别、TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤发生部位及淋巴结转移等因素，CysTLR-1 mRNA仍然是影响患者预后的危险因素。这与王欣等[10]和张世强等[11]的研究结果类似。肿瘤细胞的CysLTR分布密集，LTD4激活CysLTR-1，激活β-连环蛋白信号，从而提高TCF/LEF启动子活性，促进肿瘤增殖[12]。编码CysLTR-1基因位于X染色体的q13-21区，DNA编码337个氨基酸，多以二聚体或多聚体形式存在。CysLTR-1通过诱导上皮细胞分泌生长因子、介导炎性介质生成，破坏细胞正常微环境，促使肿瘤细胞扩散。Ding等[13]在胰腺癌细胞系中通过合用环氧合酶2和5-脂氧合酶抑制剂，有效抑制胰腺癌细胞的CysTLR表达及血管生长因子，提示CysTLR促肿瘤增殖效应可被相应的受体拮抗剂所阻断，通过损伤CysLTR-1信号通路，引起肿瘤细胞凋亡。因此笔者认为CysLTR-1表达与胰腺癌的发生发展及预后具有重要联系。

综上所述，CysTLR-1 mRNA在胰腺癌组织中表达增高，且CysTLR-1表达量与患者的预后有关，可作为判断胰腺癌预后的分子标志物。

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(本文编辑：葛 俊)

Expression of cysteinyl leukotriene receptor-1 in pancreatic cancer tissue and its clinical significance

MENGYan,ZHUYing,ZHANGYaqing,etal.

(EmergencyDepartment,LongwanBranchofCentralHospitalofHuludao,Huludao,Liaoning125001,China)

Objective To investigate the expression of cysteinyl leukotriene receptor-1 (CysLTR-1) in pancreatic cancer tissue and its association with clinical features and prognosis. Methods A total of 42 patients with pathologically confirmed pancreatic cancer who were admitted to Central Hospital of Huludao from January to October, 2015 were enrolled, and cancer and adjacent tissues were collected. Real-time PCR was used to measure the relative mRNA expression of CysLTR-1 in these tissues, and the patients were followed up for 1 year. Thet-test was used for comparison of continuous data between groups; an analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the least significant differencet-test was used for comparison between any two groups. The multivariate logistic regression analysis was used to determine influential factors for the prognosis of patients with pancreatic cancer. Results The cancer tissues had significantly higher relative mRNA expression of CysLTR-1 than adjacent tissues (0.037 1±0.020 5 vs 0.016 8±0.011 4,t=6.58,P<0.001). The relative mRNA expression of CysLTR-1 was associated with TNM stage (t=2.731,P=0.009), degree of tumor differentiation (F=10.537,P<0.001), and lymph node metastasis (t=3.408,P=0.002). During the 1-year follow-up, 17 patients died and 25 survived; the patients who died had significantly higher relative mRNA expression of CysLTR-1 than those who survived (0.045 6±0.021 7 vs 0.031 3±0.019 8,t=2.21,P=0.03). The logistic regression analysis showed that TNM stage (OR=6.92, 95%CI: 1.30-36.82,P=0.02), degree of tumor differentiation (OR=5.71, 95%CI: 1.44-22.62,P=0.01), and lymph node metastasis (OR=9.62, 95%CI: 2.23-41.46,P<0.001) were prognostic factors for pancreatic cancer. After adjustment for age, sex, TNM stage, degree of tumor differentiation, tumor location, and lymph node metastasis, the mRNA expression of CysLTR-1 was still a prognostic factor for patientswith pancreatic cancer (OR=1.11, 95%CI: 1.07-1.15,P=0.03). Conclusion CysLTR-1 is involved in the development and progression of pancreatic cancer and can be used as a new molecular marker for prognostic evaluation in patients with pancreatic cancer.

pancreatic neoplasms； receptors， leukotriene； tumor markers， biological

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.01.029

2016-09-06；

2016-09-20。

孟艳(1980-)，女，主治医师，主要从事胰腺癌、肝纤维化的诊治研究。

R735.9

A

1001-5256(2017)01-0133-04