尼罗罗非鱼补体C9基因的克隆和组织表达分析

胡欣欣，曹建萌，卢迈新，陈 琼，陈昆平

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广州 510380；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)

尼罗罗非鱼补体C9基因的克隆和组织表达分析

胡欣欣1,2，曹建萌1，卢迈新1，陈 琼1,2，陈昆平1,2

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广州 510380；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)

为了探究补体C9在尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)免疫中发挥的作用，本研究克隆并分析了尼罗罗非鱼补体C9基因(OnC9)。结果显示：OnC9的cDNA序列全长2 502 bp，包含1 761 bp的开放阅读框(ORF)，编码586个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明，OnC9与牙鲆(Paralichthysolivaceus)补体C9氨基酸相似性最高，达73.0%，与其他鱼类补体C9的相似性介于49.3%～71.4%之间。实时荧光定量PCR检测结果表明，OnC9基因在所检测的各个组织或器官中表达水平有明显差异，在肝脏中表达量最高，其次是肠道、后肾、皮肤、肌肉、鳃，在脑、脾脏、心脏、头肾、胸腺和血液中表达量最低。在无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)感染鱼体后，肝脏、后肾等组织中OnC9表达量表现为在感染12 h、48 h(或36 h)、120 h先后出现三个峰值的波动表达的规律。说明OnC9在无乳链球菌感染尼罗罗非鱼后的免疫应答中发挥作用。

尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)；补体C9；无乳链球菌；组织表达分析

补体系统(Complement System)是由一组可溶性蛋白、膜结合性蛋白和补体受体组成的蛋白反应系统，是一个高度复杂的免疫防御系统，具有诱导炎症反应，介导病原体的溶解与吞噬、免疫复合体的溶解等关键作用[1-3]。在鱼类中，补体激活途径有三种：经典途径(Classical complement pathway，CCP)、凝集素途径(Lectin complement pathway，LCP)、旁路途径(Alternative complement pathway，ACP)[4-5]。这三种途径活化后，机体都将产生膜攻击复合体(Membrane attack complex，MAC)[6]。MAC是由C5b、C6、C7、C8和12-18个C9分子组成的两性成孔结构，可聚合在靶细胞表面，通过增加其通透性，导致靶细胞死亡，是补体介导细胞死亡的一种重要机制[7-8]。已有研究表明，天然单体补体C9作为单链糖蛋白可直接造成靶细胞的裂解，是介导MAC在靶细胞表面组装的重要分子[9]。据报道，从人血清中提取的补体C9，即使在没有其它补体组分的情况下，也能快速地引起细菌的完全死亡[10]。近年来，在草鱼(Ctenopharyngodonidella)[11]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[12]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[13]等中已有补体C9基因的研究报道。而补体C9作为介导靶细胞凋亡的重要组分，在尼罗罗非鱼中还没有相关研究。

罗非鱼，属鲈形目(Perciformes)鲡鱼科(Cichlidae)，是我国淡水鱼类养殖优势品种，但近年来链球菌病严重制约了罗非鱼产业的可持续发展。当前认为，进行抗链球菌病罗非鱼新品种的定向选育和应用疫苗对该病进行免疫预防是解决罗非鱼链球菌病的两种可行的方法[14]。而上述工作都依赖于对罗非鱼免疫基因和免疫机制的系统的研究。本研究选择尼罗罗非鱼免疫相关基因补体C9 (OnC9)为对象，既克隆了OnC9全长cDNA序列，又应用实时荧光定量PCR (Real-time Quantitative PCR，qPCR)技术分析其在健康鱼不同组织中的表达情况，也了解无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)感染之后OnC9基因表达的变化，旨在探究OnC9在罗非鱼免疫中的功能，为后续研究疫苗发挥免疫预防功能的分子机理、开发该基因潜在的抗链球菌病相关分子标记奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本实验所用尼罗罗非鱼8.5日龄胚胎和幼鱼均取于中国水产科学研究院珠江水产研究所高要养殖实验基地。幼鱼平均体质量为45 g，于实验室暂养一周后，解剖4尾健康尼罗罗非鱼，收集脑、后肾、脾脏、心脏、肝脏、鳃、肌肉、头肾、皮肤、胸腺、肠道、血液等组织样本，放入1.5 mL RNase-free冻存管中，液氮冻存，备用。

SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit和Advantage®2 PCR Enzyme System购于Clontech公司。2×EasyTaq®PCR SuperMix、总RNA提取试剂Trizol Reagent试剂盒、All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR Kit、TransStart®Top Green qPCR SuperMix购于北京全式金生物技术有限公司；PrimeScriptTMII 1st strand cDNA Synthesis Kit、E.coliDH5α、pMT19-T Vecter、反转录RNA PCR Kit购于TaKaRa；用于琼脂糖凝胶回收的试剂盒购于Omega公司。TIANgel Purification Kit购于天根生化科技有限公司。同时，本实验的引物合成、测序都是由广州艾基生物工程有限公司完成。

1.2 感染实验

实验前进行无乳链球菌感染罗非鱼实验，确定半致死浓度。具体实验过程如下：随机取尼罗罗非鱼150尾，平均分为5组，每组30尾(4个实验组，1个对照组)。37 ℃条件下培养无乳链球菌12 h，浓度经测定为0.99×109CFU/mL。然后用磷酸盐缓冲液将其浓度稀释到104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL和107CFU/mL。实验组每尾鱼腹腔注射200 μL，对照组注射等体积磷酸盐缓冲液。病鱼呈现打转，不规则游动等非正常状态。7 d天之后，预验结果为：104CFU/mL组死亡2尾，105CFU/mL组死亡12尾，106CFU/mL组死亡26尾和107CFU/mL组死亡29尾，经计算确定105CFU/mL为该批次实验的半致死浓度。

取健康尼罗罗非鱼160尾，平均分到5个100 L水族箱中，一箱用作对照组，剩余用作实验组。实验组腹腔注射无乳链球菌(105CFU/mL)200 μL，对照组注射等体积的PBS缓冲液。细菌感染0、4、8、12、24、36、48、72、120、168 h，分别取4尾尼罗罗非鱼的肝脏、肠道、后肾、皮肤、肌肉、鳃放入1.5 mL RNase-free冻存管中，液氮冻存，备用。

1.3 RNA提取和反转录

根据总RNA提取试剂Trizol Reagent试剂盒的操作说明，提取8.5日龄胚胎总RNA和幼鱼各组织RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的提取效果，并用核酸蛋白定量仪(Bio-Rad Smartspic plus)检测RNA纯度和完整性。制备8.5日龄尼罗罗非鱼cDNA，按照PrimeScriptTMII 1st strand cDNA合成试剂盒(TaKaRa)说明书进行操作；RACE-Ready cDNA的制备，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)说明书进行操作。qPCR cDNA的制备，按照All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR Kit(全式金)说明书进行操作。实验所用PCR引物见表1。

表1 尼罗罗非鱼OnC9基因克隆和组织表达所用引物Tab.1 Primers used for amplifying cDNA and analyzing expression for the OnC9 gene in O. niloticus

以尼罗罗非鱼补体C9的预测序列(登录号：XM-003449649.2)为模板，用Primer 5.0软件设计一对引物C9-f和C9-r，以8.5日龄的尼罗罗非鱼总cDNA为模板扩增OnC9 cDNA的中间片段。PCR反应体系为：2×Taq MasterMix 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板0.5 μL，ddH2O 11 μL，Total 25 μL。扩增条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR结束之后，其反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。用TIANgel Purification Kit回收纯化目的片段，把纯化的目的片段与载体pMD-19T连接，连接产物转入E.coliDH5α感受态细胞中，均匀涂布于含氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB平板上，37 ℃条件下过夜培养，挑取单克隆经PCR检测后获得阳性克隆，送到广州艾基生物技术有限公司进行测序。

根据已获得的中间片段，设计上游5’RACE引物C9-5’RACE-T、C9-5’RACE-N和下游3RACE引物C9-3RACE-1T、C9-3RACE-1N、C9-3RACE-2T、C9-3RACE-2N，与SMARTer试剂盒中自带的通用引物UPM和NUPM，通过巢式PCR扩增OnC9基因的3端和5’端。反应条件：PCR扩增程序1：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增程序2：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃延伸3 min，25个循环；72 ℃延伸10 min。结束之后，其产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物的纯化、连接、阳性克隆检测和测序与中间片段克隆的步骤相同。

1.5 生物信息学分析

使用NCBI网站的BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)软件对测序后所得序列进行同源性检索，用DNAMAN软件进行序列拼接，得到全长cDNA序列。利用ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)在线确定开放阅读框并预测氨基酸序列；ExPASy网站的ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白质的分子质量、等电点；SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析蛋白的信号肽；TMHMM软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)对蛋白进行跨膜区域预测；利用PSORT (http://psort.hgc.jp/)进行蛋白亚细胞定位；SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)在线分析蛋白结构；ExPASy网站的PROSITE (http://prosite.expasy.org/prosite.html)在线预测氨基酸功能域。

使用软件clustalX进行氨基酸的多序列比较，DNASTAR中的MegAlign比较不同物种同源基因的相似性。MEGA 5.1软件中的邻接法(Neighbor-Joining，NJ法)构建系统进化树。

1.6 OnC9基因组织表达分析

根据已克隆得到的OnC9 cDNA序列，设计qPCR引物，将4尾健康尼罗罗非鱼的12个健康组织(脑、后肾、脾脏、心脏、肝脏、鳃、肌肉、头肾、皮肤、胸腺、肠道、血液)和无乳链球菌感染后的6个相关组织的RNA反转录成cDNA，以反转录成的cDNA为模板进行qPCR。同时，根据已克隆出的OnC9 cDNA序列设计特异性引物C9-q，以EF-1α为内参基因进行qPCR，反应体系为：10 μL 2×TransStart®Top Green qPCR SuperMix，引物各0.4 μL，passive Reference Dye(50×) 0.4 μL，ddH20 7.8 μL，cDNA模板1.0 μL。反应程序为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。qPCR反应在ABI Stepone plus荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems)上进行，每个待测cDNA样品设置三个重复。qPCR数据分析采用相对定量2-ΔΔCt法，用SPSS 20软件对数据进行单因子方差分析(One-Way ANOVA)，用Duncan多重比较进行差异显著性分析。

2 结果

2.1 OnC9 cDNA克隆和序列分析

结果序列包含1 761 bp的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，编码586个氨基酸，5’非翻译区(Untranslated region，UTR)长133 bp，3UTR长608 bp。在3UTR区出现1个mRNA不稳定性信号ATTTA和1个多聚腺苷酸加尾信号AATAAA(图1)。使用ProtParam分析OnC9前体蛋白的理化性质，推测其分子式为C2787H4413N813O895S44，分子质量是65.04 ku，等电点(pI)为5.99，半衰期是30 h，不稳定指数是39.86，属于稳定蛋白。亲水性平均指数是-0.557，属于亲水性蛋白。经SignalP 4.1 Server在线分析可知，OnC9蛋白第1～27个氨基酸是信号肽，27～28氨基酸之间为可能的剪切位点。经TMHMM在线预测可知，该蛋白586个氨基酸全部位于膜外，属分泌蛋白。PSORT分析结果也证实OnC9蛋白主要在胞外(胞外82%、溶酶体19%、内质网20%)。

OnC9存在血小板反应素1(Thrombospondin 1，TSP1)结构域、低密度脂蛋白受体A(LDL-receptor class A， LDLRA)结构域、膜攻击复合物/穿孔素(Membrane attack complex/perforin，MACPF)结构域和表皮生长因子(Epidermal growth factor-like domain，EGF-Like)结构域。TSP1结构域对应的氨基酸区段为：38～88和546～582；LDLRA结构域对应的氨基酸区段为：94～130；MACPF结构域对应的氨基酸区段为：275～487；EGF-Like结构域对应的氨基酸区段为491～524。另外，使用PROSITE软件搜索到OnC9还存在其它一些推断的蛋白位点：13个N端豆蔻酰化位点G[^EDRKHPFYW]-x{2-[STAGCN][^P]位于G14、G64、G67、G315、G325、G366、G369、G416、G500、G535、G544、G557、G570，13个酪蛋白激酶II磷酸化位点[ST]-x{2}-[DE] (aa45～48、74～77、96～99、124～127、199～202、237～240、254～257、264～267、334～337、355～358、438～441、445～448、455～458)。10个蛋白激酶C磷酸化位点[ST]-x-[RK] (aa53～55、130～132、233～235、287～289、348～350、355～357、393～395、412～414、423～425、525～527)等。另外还存在1个酰胺化位点x-G[RK][RK] (aa557～560)和一个细胞黏着序列RGD (aa577～579)。

2.2 同源比较和系统进化分析

使用DNASTAR中的MegAlign软件将OnC9氨基酸序列和已报道的序列进行同源性分析，OnC9与牙鲆(序列登陆号：BAA86878)、红鳍东方鲀(Fugurubripes，AAC60288)、底鳉(Fundulusheteroclitus，AAR87007)、虹鳟(CAJ01692)、香鱼(Plecoglossusaltivelis，CBX31962)、草鱼(ABN49522)、人(Homosapiens，NP-001728)、小鼠(Musmusculus，NP-038513)、牛(Bostaurus，NP-001030441)、家兔(Oryctolaguscuniculus，NP-001075815)、爪蟾(Xenopuslaevis，NP-001079814)等物种的补体C9的氨基酸序列同源性分别为：73.0%、71.4%、63.9%、57.9%、54.3%、49.3%、38.3%、38.2%、41.9%、39.3%、40.6%。

图1 尼罗罗非鱼OnC9基因cDNA全序列及推测氨基酸序列Fig.1 Full-length cDNA and deduced amino acid sequences of the C9 gene in O.niloticus数字代表该行末核苷酸位点，加粗数字代表该行末氨基酸位点，椭圆标识起始密码子和终止密码子，粗斜体标示多聚腺苷酸加尾信号，粗体字为poly(A)，大括号标示N-糖基化位点，下划线标示为cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点，波浪线标示为蛋白信号肽，双下划线所示为LDLRA信号序列，方框所示为MACPF信号序列，灰色阴影表示EGF信号序列。

利用MEGA 5.1软件对OnC9氨基酸序列与其他物种的补体C9氨基酸序列进行邻接聚类分析(图2)。在系统进化树中，尼罗罗非鱼首先与牙鲆、红鳍东方鲀聚类，然后与虹鳟、底鳉、香鱼、草鱼等聚为一簇；人和哺乳动物聚为一支，而两栖类的非洲爪蟾单独为一支，位于前面两大分支的中间。

图2 尼罗罗非鱼补体C9基因和其它动物的NJ分子进化树Fig.2 NJ-phylogenetic tree of C9 genes constructed by using amino acid sequences

对尼罗罗非鱼和其它脊椎动物进行氨基酸多重序列比对，结果显示参与比对的脊椎动物都具有TSP1、LDLRA、MACPF、EGF-Like结构域，哺乳动物仅N端存在一个TSP1结构域，鱼类和两栖类的补体C9氨基酸序列在C端和N端各存在一个TSP1结构域，哺乳动物C端不存在TSP1结构域(图3)。

图3 鱼类、两栖类和哺乳动物补体C9 C末端序列比对Fig.3 Multiple alignment of C-terminal amino acid sequences of fish, amphibians and mammalian C9

2.3 OnC9基因在健康尼罗罗非鱼不同组织中的表达分析

qPCR检测结果表明，OnC9基因在所检测的12个组织器官(脑、后肾、脾脏、心脏、肝脏、鳃、肌肉、头肾、皮肤、胸腺、肠道、血液)中表达水平有明显差异。OnC9在肝脏中表达量最高，其次是肠道、后肾、鳃、皮肤，在肌肉中表达量比较低，脑、脾脏、心脏、头肾、胸腺和血液中表达量最低。

图4 尼罗罗非鱼补体C9基因在不同组织中的表达分析Fig.4 Tissue distribution of the OnC9 gene in O. niloticus相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示显著性差异(P<0.05)。

2.4 感染无乳链球菌后OnC9基因表达变化分析

尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后，不同时段下肝脏、肠道、后肾、肌肉等组织的OnC9表达变化如图5所示。

图5 无乳链球菌感染后尼罗罗非鱼补体C9 基因在尼罗罗非鱼中各组织的表达情况Fig.5 Quantitative expression profile of O. niloticus C9 gene after the challenge with Streptococcus agalactiae

3 讨论

3.1 OnC9序列结构及同源性分析

本研究克隆得到的5’UTR和3UTR序列比预测序列更长更完整。相似性分析显示，克隆得到的序列与预测序列相似性为99%。在本研究中，OnC9同样存在TSP1、LDLRA、MACPF、EGF-Like结构域；与其它硬骨鱼类一样，OnC9具有两个TSP1结构域，在氨基酸序列C端比哺乳动物多一个TSP1结构域。MAC中的C6，C7，C8α，C8β同样存在重复的TSP1结构域，所以从分子结构方面来说，OnC9的氨基酸序列与被广泛接受的其他物种的补体C9推导序列非常相似[11-13]。

NJ系统进化树显示，OnC9氨基酸序列与鱼类的相似性为49.3%～73.0%，与哺乳类的相似性为38.2%～41.9%，与两栖类补体C9的相似性为40.6%。同进化树显示结果一样，OnC9与鱼类有较高的同源性，可进一步确定得到的序列为补体C9氨基酸序列。同时，在系统进化树中，尼罗罗非鱼首先与牙鲆(鲽形目)、红鳍东方鲀(鲀形目)聚类，然后与虹鳟(鲑形目)、草鱼(鲤形目)等聚为一簇，这与传统分类观点一致，即鲤形目的鱼类是最先从鱼类祖先中进化出去的，然后是鲑形目种类，而鲀形目和鲽形目鱼类则被认为是种类众多的、较为高等的鲈形目中进化出来的[15]。

3.2 OnC9组织表达特征

在哺乳动物中，肝脏是大多数补体成分的主要产生部位[16-17]。补体C9在硬骨鱼中的表达模式也类似。在草鱼中，补体C9在肝脏的表达量最高，其次是脾、头肾等[11]；条石鲷(Oplegnathusfasciatus)补体C9在肝脏的表达量最高，其次是血液和脑[18]；鮸(Miichthysmiiuy) 补体C9在肝脏中表达量非常高，其次是眼睛[15]。健康尼罗罗非鱼补体C9在后肾、肝脏、鳃、肌肉、皮肤、肠道中均有表达，主要在肝脏中表达，在肠道、后肾、鳃、肌肉、皮肤中有少量表达。本实验同其它鱼类补体C9荧光定量实验结果一样：补体C9在肝脏的表达量最高，这同时也验证了肝脏是合成补体的主要器官[17-19]。另外，条石鲷和尼罗罗非鱼同属鲈鱼目，条石鲷补体C9在肝脏的表达量最高，其次是血液和脑，OnC9表达其次是肠道和后肾，这可能由于检测的补体C9基因属于两个亚型。

无乳链球菌是危害罗非鱼的主要病原之一。因此，亟需对无乳链球菌感染后尼罗罗非鱼的免疫反应进行研究。本研究表明，无乳链球菌感染尼罗罗非鱼168 h内，肝脏、肠道、后肾、皮肤、肌肉、鳃中的OnC9表达量均表现为在感染后12 h、48 h(或36 h)、120 h先后出现三个峰值的波动式表达的规律，这与赵雪锦[20]在“粉玉”体色瓯江彩鲤中的发现一致。此外，孟繁星[15]对鮸注射鳗弧菌(Vibrioanguillarum)后，补体C9的表达同样呈现波动式表达的规律。qPCR结果表明无乳链球菌感染尼罗罗非鱼可有效诱导肝脏中OnC9的表达。同“粉玉”体色瓯江彩鲤、鮸等一样，在尼罗罗非鱼中，相对于其它组织，OnC9在肝脏中的表达是非常高的，这表明OnC9和大多数补体成分一样，属于急性期蛋白(acute phase protein，APP)[16, 21]。动物体内APP具有多种结构和功能，并且它们在炎症反应中促进组织修复和再生，从而使机体回复到内稳态[22]。

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(责任编辑：张潇峮)

Cloning and expression analysis of complement 9 gene in Oreochromis niloticus

HU Xin-xin1,2, CAO Jian-meng1, LU Mai-xin1, CHEN Qiong1,2, CHEN Kun-ping1,2

( 1.KeyLab.ofTropical&SubtropicalFisheryResourceApplication&Cultivation,MinistryofAgriculture,PearlRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Guangzhou510380,China; 2.CollegeofFisheries&Life,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

As a member of the complement system, complement 9 (C9) plays a key role in forming the pore-like membrane attack complex (MAC) of complement on target cells, which has the function of pore forming and is the effective component leading to cell lysis. In the present study, a full-length C9 (OnC9) cDNA ofOreochromisniloticus was 2 502 bp, containing 1 761 bp open reading frame, encoding 586 amino acids. The deduced amino acid sequence ofOnC9 shared 73.0% similarity with PoC9 (ParalichthysolivaceusC9), and 49.3%-71.4% identity with the C9 of other teleosts. Real-time quantitative PCR (qPCR) analysis demonstrated that the expression level ofOnC9 in different tissues ofO.niloticuswas significantly different, and the highest level was detected in the liver; the lower level was detected in intestine, kidney, gills, skin and muscle and the lowest level was detected in brain, spleen, heart, head kidney, thymus and blood. The expression ofOnC9 in liver, kidney and the other tissues appeared three peaks fluctuating at 12 hours, 48 (or 36) hours and 120 hours after infection ofStreptococcusagalactiae. The results suggested thatOnC9 may play an important role in tilapia immune response of anti-bacteria.

Oreochromisniloticus; C9;Streptococcusagalactiae; expression analysis

2016-04-18；

2016-09-06

现代农业产业技术体系专项资金(CARS-49)；国家自然科学基金(31502205)；广东省自然科学基金(2014A030310337)

胡欣欣(1991- )，女，硕士，专业方向为罗非鱼遗传育种。E-mail:15139794169@163.com

卢迈新。E-mail: mx-lu@163.com

S917

A

1000-6907-(2017)01-0003-09