福瑞鲤对氨氮胁迫的生理响应

李利红，袁宏利

(山西省水产科学研究所，太原 030006)

福瑞鲤对氨氮胁迫的生理响应

李利红，袁宏利

(山西省水产科学研究所，太原 030006)

以福瑞鲤(Cyprinuscarpio)为材料，研究不同浓度氨氮(0、10、20和30 mg/L)处理对幼鱼鳃组织中抗氧化系统和Na+/K+-ATP酶活力的影响。结果显示，氨氮胁迫6 h诱导H2O2含量、总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活性迅速显著升高，并在胁迫24 h时达到最高水平。胁迫96 h后，各处理组H2O2含量、SOD 活性和总抗氧化能力均低于对照组水平，MDA含量显著增加。氨氮胁迫后，Na+/K+-ATP酶基因转录水平和蛋白活性呈先降低后升高又降低的变化趋势，参与胁迫过程中渗透压的调控。研究结果表明，低浓度氨氮胁迫后，福瑞鲤鳃组织通过调节细胞抗氧化能力，提高Na+/K+-ATP酶活性，有效改善鱼体的抗氨氮胁迫能力，但是高浓度氨氮胁迫对鳃组织造成氧化损伤。

福瑞鲤(Cyprinuscarpio)；氨氮；鳃组织；Na+/K+-ATP酶；抗氧化能力

近年来，在规模化集约化水产养殖中，高放养密度和高投饲率使得水体中的残饵、肥料和生物排泄物等不断增多，经氨化作用产生大量的氨氮，成为目前水产养殖中影响鱼类的主要胁迫因子之一[1-2]。养殖水体中的氨氮浓度经常会在短时间内急剧升高，通过鱼鳃进入体内，使鱼体的鳃、肾和肝组织结构发生病变、免疫力下降，生长、发育受阻，甚至导致死亡，严重影响水产品的产量和品质[3-4]。目前，国内外进行了许多关于氨氮胁迫对水生动物影响的研究。据报道，氨氮胁迫处理尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrusvachelli)后，造成组织中蛋白质氧化和膜脂过氧化，导致肝功能衰竭，非特异性免疫防御系统遭到破坏[5]。然而，氨氮胁迫对鱼体鳃组织抗氧化系统影响的研究甚少。

福瑞鲤(FFRC strain common carp，Cyprinuscarpio)是2011年由建鲤和野生黄河鲤杂交获得的鲤新品种，具有生长速度快、体型好、饵料转化率高、适应能力强和遗传性状稳定等特点，是农业部“十二五”主推的大宗淡水养殖鱼类之一[6]。本试验以福瑞鲤为材料，研究氨氮胁迫对福瑞鲤幼鱼鳃组织抗氧化系统和Na+/K+-ATP酶活性的影响，探讨氨氮对鱼类的毒性机理以及福瑞鲤对养殖水体环境变化的适应性，旨在为淡水鱼类健康养殖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用福瑞鲤幼鱼购自长治沁县渔场，体质量(50.00±0.16)g。试验前室内暂养2周，日投食2次。养鱼用水为曝气自来水，水温(25±1)℃，pH 7.5±0.3，用充氧机连续充气以保证溶解氧含量以上，正式实验前停食24 h。

1.2 染毒实验

鱼类染毒采用静态水质接触染毒法。通过预实验，在确定福瑞鲤幼鱼96 h 氨氮半致死浓度(25 ℃，T-AN:35.6 mg/L)的基础上，设置1个对照组(0 mg/L)和3处理组(总氨氮T-AN=10 、20 和30 mg/L)，每个处理设3个平行组。用氯化铵(NH4Cl)配制各实验组总氨氮浓度100 L，随机放入健康活泼的福瑞鲤20尾。实验期间每天定时换水，采用萘氏试剂法测定并调整总氨氮浓度。

1.3 样品采集与分析

在染毒 6、24、48 和96 h后，各实验组随机取福瑞鲤3尾，分别用自来水、蒸馏水冲洗后迅速解剖。取新鲜的第2鳃弓上的鳃丝，用生理盐水润洗，滤纸吸干水分。准确称量组织质量，按质量体积比制成10%的组织匀浆，4 ℃下3 500 r/min离心10 min，取上清液待用。Na+/K+-ATP酶活性、H2O2含量、SOD活性、总抗氧化力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，测定方法及单位参照试剂盒说明书。

数据为3个平行组的平均值±标准差(mean±SD)，用SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan 多重比较分析处理组与对照组间的差异显著性，取*P<0.05为差异显著，**P< 0.01为差异极显著。

1.4 RNA提取和Real-time PCR分析

取对照组和20 mg/L处理组染毒 6、24、48 和96 h后福瑞鲤幼鱼第2鳃弓上的鳃丝，利用TaKaRa RNAiso Reagent提取总RNA。以总RNA为模板，使用PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa)合成cDNA。根据建鲤Na+/K+-ATP酶基因序列，设计Na+/K+-ATP酶α1和β1引物对分别为ATPα1FG、ATPα1RG和ATPβ1FG、ATPβ1RG。以β-actin基因作内参，引物对为Neican F和Neican R(表1)。利用SYBR®Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒进行Real-time PCR分析，反应采用Applied Biosystems 7500 Real time PCR仪。每个样品重复三次，使用2-ΔΔCt计算方法，各组间比较采用独立样品t检验，P< 0.05 时差异显著。

表1 Na+/K+-ATPα1和β1基因Real-time PCR所用引物

Tab.1 The primers used by Na+/K+-ATPase α1and β1 genes

引物序列ATPα1FG5'-GTGGGCCGATTTGATCATTTGC-3'ATPα1RG5'-CCTGGGCTGCGTCGAATGATAAG-3'ATPβ1FG5'-GCACAGGCAGCAGTTGGTTCAAG-3'ATPβ1RG5'-CGTATTATCGCTCATGGAGAAGCTGATC-3'NeicanF5'-GTTGTCAGCAATGCCTCCTGC-3'NeicanR5'-ACTGGCACCGCGACCATC-3'

2 结果

2.1 氨氮胁迫对福瑞鲤鳃组织H2O2含量的影响

氨氮胁迫后，福瑞鲤幼鱼鳃组织H2O2含量呈上升趋势(图1)。氨氮胁迫6 h时，鳃组织H2O2含量迅速升高。胁迫24 h后，各胁迫组H2O2含量呈浓度依赖性增高，与对照组相比差异极显著(P<0.01)。之后，随着氨氮胁迫时间的延长，鳃组织H2O2含量增幅降低。氨氮胁迫96 h后，仅10 mg/L组与对照组差异显著(P<0.05)，其它各组均恢复至对照组水平。

2.2 氨氮胁迫对福瑞鲤鳃组织抗氧化能力的影响

氨氮胁迫对福瑞鲤幼鱼鳃组织T-AOC和SOD活性产生显著影响(图2)。 氨氮胁迫6 h时，鳃组织T-AOC迅速增加。胁迫24 h后，各胁迫组T-AOC达到最大，与对照组相比差异极显著(P<0.01)。之后，随着氨氮胁迫时间的延长，鳃组织T-AOC仍显著高于对照组，但增幅降低。氨氮胁迫96 h后，各胁迫组T-AOC均低于对照组，20 mg/L胁迫组与对照组相比差异显著(P<0.05)。氨氮胁迫6 h时，鳃组织SOD活性迅速提高至最大，10 mg/L和20 mg/L胁迫组与对照组差异极显著(P<0.01)，30 mg/L胁迫组与对照组差异显著(P<0.05)。随着氨氮胁迫时间的延长，鳃组织SOD活性增幅降低。胁迫48 h后，30 mg/L胁迫组显著降低(P<0.05)，其余各组与对照组相比无显著差异。

氨氮胁迫后福瑞鲤鳃组织MDA含量呈时间和浓度依赖性提高(图2)。胁迫6 h后，鳃组织MDA含量呈浓度依赖性增加，但与对照组间无显著差异。胁迫24 h时，30 mg/L胁迫组MDA含量显著高于对照组(P<0.05)，而其他各组差异不显著。48 h时，20 mg/L和30 mg/L胁迫组MDA含量显著高于对照组(P<0.05)。胁迫96 h后，各胁迫组MDA含量均达到最大峰值，10 mg/L和20 mg/L胁迫组与对照组差异显著(P<0.05)，30 mg/L胁迫组与对照组差异极显著(P<0.01)。

图1 氨氮胁迫对福瑞鲤幼鱼鳃组织H2O2含量的影响Fig.1 Effects of ammonia exposure on H2O2 content in the gill of C.carpio

图2 氨氮胁迫对福瑞鲤幼鱼鳃组织抗氧化能力的影响Fig.2 Effects of ammonia exposure on antioxidative capacity in the gill of C.carpio

2.3 氨氮胁迫对福瑞鲤鳃组织Na+/K+-ATP酶基因转录和蛋白活性的影响

福瑞鲤幼鱼鳃组织Na+/K+-ATP酶基因转录和蛋白活性水平在氨氮胁迫过程中发生明显改变(图3)。氨氮胁迫6 h时，Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表达无明显变化。之后，Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表达量随着胁迫时间的延长逐渐升高，Na+/K+-ATP酶α1基因在胁迫48 h 时达到最大。Na+/K+-ATP酶β1基因表达变化较Na+/K+-ATP酶α1基因更为明显，胁迫24 h即达到最大，胁迫48 h时仍显著增高。氨氮胁迫96 h后，Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表达量迅速下降，Na+/K+-ATP酶β1基因转录水平显著降低。

氨氮胁迫6 h时，鳃组织Na+/K+-ATP酶活性迅速下降，但胁迫组与对照之间无显著差异。之后，随着氨氮胁迫时间的延长，鳃组织Na+/K+-ATP酶活性呈浓度依赖性增高，在胁迫48 h后，Na+/K+-ATP酶活性达到最大，与对照组相比差异极显著(P<0.01)。氨氮胁迫96 h时，鳃组织Na+/K+-ATP酶活性回落，但除30 mg/L组显著降低外(P<0.05)，其余各组与对照组相比无显著差异。

图3 氨氮胁迫对福瑞鲤幼鱼鳃组织Na+/K+-ATP酶的影响Fig.3 Effects of ammonia exposure on Na+/K+-ATPase in the gill of C.carpio

3 讨论

水体中高浓度氨氮会阻断鱼体内氨的排泄，使血液和组织中氨氮的含量上升。同时，环境中氨通过鳃上皮渗入鱼体内，对鱼体细胞产生一系列毒害作用[7]。当受到环境胁迫时，鱼体细胞内产生大量的活性氧，使蛋白质、核酸、膜脂等生物大分子结构损伤、功能异常，导致细胞生理活动紊乱，引起细胞凋亡等[8-9]。生物体内存在一套完整的抗氧化防御系统，包括抗氧化物质和抗氧化酶等，可以清除胞内过量的活性氧，从而维持相对的动态平衡[10-11]。研究表明，氨氮胁迫诱导青鱼、罗非鱼和凡滨滨对虾出现氧化应激，过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽含量等发生改变[7，11]。本研究中，氨氮胁迫初期，福瑞鲤幼鱼鳃组织内产生大量的H2O2，SOD活性和T-AOC迅速增高，MDA含量较低，说明氨氮胁迫后福瑞鲤幼鱼鳃组织中抗氧化能力提高，有效清除胁迫产生的活性氧，维持细胞正常的生理功能。但随着氨氮胁迫时间的延长，胞内过量的活性氧不能及时清除，从而造成组织细胞损伤，SOD活性降低，MDA含量显著增加。MDA是膜脂过氧化的产物，可间接反映细胞的损伤程度，同时又可与蛋白质的游离氨基作用，引起蛋白质分子内和分子间的交联，进一步导致细胞损伤[12]。这预示着随着氨氮胁迫时间的延长，福瑞鲤鳃组织脂质过氧化反应增强，细胞抗氧化酶活性降低，从而引起细胞生理活动紊乱。

Na+/K+-ATP 酶是生物膜上存在的一种蛋白酶，由一个α亚基和一个β亚基组成[13]。据报道，许多环境因素如盐度、重金属及臭氧等都可影响到鳃组织Na+/K+-ATP酶活性[14]。研究结果表明，氨氮胁迫后，福瑞鲤幼鱼鳃组织Na+/K+-ATP酶α1和β1基因表达量产生明显影响，且基因转录水平的变化与氨氮胁迫浓度相关，这为从分子水平上阐明胁迫过程中的渗透调节机制奠定了基础。Na+/K+-ATP 酶活性先下降后升高，最后又回到对照水平。氨氮胁迫初期，环境中高浓度氨氮渗入鱼体细胞，使得Na+/K+-ATP 酶蛋白结构改变而导致酶活力下降。之后，鳃主动渗透调节机制被激活，Na+/K+-ATP 酶活性提高。最后，由于鳃组织中积累了大量的活性氧，脂质过氧化产物破坏Na+/K+-ATP 酶结构，导致酶活力降低[7,15]。

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(责任编辑：陈细华)

Physiological response of FFRC strain common carp to ammonia stress

LI Li-hong,YUAN Hong-li

(FisherySciencesResearchInstituteofShanxiProvince,Taiyuan030006,China)

The effects of ammonia-N on antioxidant system and Na+/K+-ATPase were studied in the gill of FFRC strain common carp (CyprinuscarpioL.).The carp were transferred off the freshwater and exposed to different ammonia-N levels (0,10,20 and 30 mg/L),and each ammonia-N level was randomly triplicate and sampled at 0,6,24,48 and 96 h,respectively.The results showed that with the concentration of ammonia-N increased,the H2O2content,total antioxidant capacity (T-AOC) and superoxide dismutase (SOD) activity enhanced significantly at first 6 h and reached the maximun after 24 h exposure.Then,the H2O2content,SOD activity and T-AOC decreased,and MDA content increased significantly in all ammonia-N treatment group after 96 h exposure.The gene expression level of Na+/K+-ATPaseα1 and Na+/K+-ATPaseβ1 increased at 24 h,and then decreased to be lower than that of control group after 96 h exposure.Meanwhile,Na+/K+-ATPase activities decreased at first 6 h,and then increased gradually and reached the maximum at 48 h,showing the induction of Na+/K+-ATPase in response to ammonia-N stress.These results indicated that ammonia-N stress induced changes in antioxidant system and Na+/K+-ATPase level,which play a key role in preventing ammonia-N damage in gill cells.

carp;ammonia stress;gill;Na+/K+-ATPase;antioxidant system

2016-03-31；

2016-05-24

山西省青年科技研究基金(2013021022-5)

李利红(1982- )，女，博士，工程师，主要从事鱼类生态毒理学研究。E-mail:lihongli19821129@163.com

S965.89

A

1000-6907-(2017)01-0097-04