达氏鲟gdf11基因cDNA的克隆及组织表达特征分析

杜 浩，冷小茜，张书环，叶 欢，沈 丽，刘志刚，陈细华，危起伟

(中国水产科学研究院长江水产研究所, 农业部淡水生物多样性保护重点实验室, 武汉430223)

达氏鲟gdf11基因cDNA的克隆及组织表达特征分析

杜 浩，冷小茜，张书环，叶 欢，沈 丽，刘志刚，陈细华，危起伟

(中国水产科学研究院长江水产研究所, 农业部淡水生物多样性保护重点实验室, 武汉430223)

本研究克隆了达氏鲟(Acipenserdabryanus)生长转化因子gdf11(growth differentiation factor 11)基因cDNA。达氏鲟gdf11基因cDNA序列全长1 298 bp(不包括Poly A)，开放阅读框为1 191 bp，编码396个氨基酸，5非编码区长19 bp；3非编码区长88 bp。通过Signal P软件预测含有N端21aa的信号肽。组织表达特征分析结果显示，gdf11在7种组织中均有表达，在眼和鳃中的表达量较高；不同水流条件下，鳃和心脏gdf11的表达量有显著性差异，静水中鳃gdf11表达量是流水(流速27.0±3.0 cm/s)的4.70倍，而心脏中的表达量是流水的2.72倍。这暗示了gdf11可能在呼吸代谢中发挥功能。

达氏鲟(Acipenserdabryanus)；gdf11基因；基因克隆；组织表达特征

gdf11(growth differentiation factor 11)是近年来发现的转化生长因子-β超家族(Transforming Growth Factor β superfamily，TGF-β)成员，被认为是脊椎动物中控制中轴骨形成的关键因子。通过基因敲除，Mcpherron等[1]发现gdf11在哺乳动物前后轴特化的过程中起着重要作用。Gamer等[2]已经证明爪蟾gdf11是轴中胚层和神经组织形成的关键诱导信号。目前，有关gdf11基因在鱼类中的研究较少，但其功能似乎更加多元化。斑马鱼(Daniorerio)中，gdf11基因在精巢、卵巢、肌肉、脑和鳃中都有表达，且表达量相差不大[3]。另外，有研究证明，斑马鱼gdf11基因在肝脏和胰腺的外分泌过程中起着重要作用[4]。在金头鲷(Sparusaurata)中，gdf11基因的表达较为广泛，如脑、性腺、眼、脾、肾、鳃丝、肠、皮肤、心脏、肝、肌肉和垂体[5]。

鲟形目鱼类是现存起源最早的脊椎动物之一。达氏鲟(Acipenserdabryanus)隶属于鲟形目，为我国特有物种，主要分布于金沙江下游和长江上游。目前关于达氏鲟的研究主要集中在养殖、繁殖、发育及行为[6-8]，生态评估[9]以及物种鉴定微卫星标记[10]方面。对达氏鲟功能基因的研究，进行了deadend[11]、vasa[12]基因的表达特征和功能分析。本研究克隆了达氏鲟gdf11基因cDNA全长，分析了其与其他脊椎动物gdf11的系统进化关系，并研究了gdf11在不同组织中的表达特征。为进一步研究gdf11在脊椎动物中的功能机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

实验鱼取自长江水产研究所荆州中华鲟繁育基地人工孵化幼鱼，选用常规养殖条件(微流水)下2月龄达氏鲟分别取肝、心、脾、眼、肌肉、鳃和脑，在液氮中速冻，然后存放-80 ℃冰箱。同时采集人工造流环境(流速27.0±3.0 cm/s)[8]中同龄达氏鲟相同组织。

1.2 RNA提取及SMART cDNA合成

各种组织总RNA用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)提取，cDNA合成采用PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒，操作按照说明书进行。

取达氏鲟脑总RNA，按Super SMART® PCR cDNA Synthesis Kit操作手册的方法合成达氏鲟脑SMART cDNA，-80 ℃保存备用。

1.3 达氏鲟gdf11基因的克隆

在GenBank数据库中搜寻已知物种的gdf11基因的序列，通过Clustal X2比对分析保守区，然后运用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件设计简并引物(表1)，以合成的达氏鲟脑SMART cDNA为模板进行PCR扩增。按照peggy等[3]的方法，根据得到的达氏鲟gdf11基因扩增片段，设计上下游特异引物(表1)，以达氏鲟脑SMART cDNA为模板，分别与RACE引物进行5和3RACE 扩增，产物用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选阳性菌液送上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.4 基因序列特征分析和同源性分析

将所得序列用DNAstar软件拼接后，得到达氏鲟gdf11基因的全长cDNA序列，通过BLAST进行序列比对分析；用ORF Finder进行开发阅读框的查找，并推导其相应的氨基酸序列；运用ExPASy Molecular Biology Server 预测信号肽；DNA和氨基酸序列同源性的比较采用Clustal W软件。

1.5 达氏鲟gdf11基因的表达特征分析

根据得到的达氏鲟gdf11基因的序列，设计定量PCR引物Adgdf11-qRT-F和Adgdf11-qRT-R，以达氏鲟β-actin基因作为内参，以不同组织的cDNA为模板进行real-time PCR。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，读板温度77 ℃，读板时间5 s；40次循环，做熔解曲线分析温度为65～95 ℃。所有实验样品均重复3次。

表1 达氏鲟gdf11基因克隆所用引物Tab.1 Sequences of the primers used for gdf11 gene

2 结果

2.1 达氏鲟gdf11基因全长cDNA的克隆

根据gdf11基因家族保守的区域，设计简并引物，以达氏鲟脑SMART ds cDNA为模板，PCR扩增得到了一个大小为851 bp的片段(图1)。将该片段克隆测序后，通过BLAST进行同源搜索，结果证明为gdf11基因。然后根据扩增片段的序列，设计gdf11基因特异引物，通过3RACE-PCR的方法，获得了达氏鲟gdf11基因cDNA序列的3端，共315 bp；通过5RACE-PCR，获得了基因cDNA序列的5端，共343 bp(图2)。通过序列拼接，得到了达氏鲟gdf11基因的全长cDNA序列。

图1 达氏鲟gdf11基因保守片段的克隆Fig.1 Cloning of the conserved fragment of gdf11 gene in A. dabryanus M, DNA Marker DL2000

图2 达氏鲟gdf11基因3端和5端cDNA序列的克隆Fig.2 Cloning of the 3 and 5 end sequence of gdf11 gene in A. dabryanus M, DNA Marker DL2000

2.2 达氏鲟gdf11基因cDNA序列特征

达氏鲟gdf11基因的cDNA序列全长1 298 bp(不包括Poly A)，开放阅读框为1 191 bp，编码396个氨基酸，5非编码区长19 bp；3非编码区长88 bp(图3)。通过Signal P软件预测含有N端21aa的信号肽。

图3 达氏鲟gdf11基因全长cDNA序列及其推导的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequence of gdf11 in A. dabryanus and its deduced amino acids sequence.下划线的氨基酸为信号肽；起始密码子、终止密码子和加尾信号为粗体。

2.3 达氏鲟gdf11基因的生物信息学分析

在NCBI和Ensembl上搜索其他物种gdf11的氨基酸序列，通过比对分析发现，脊椎动物的gdf11非常保守，都含有一个潜在的蛋白水解位点RSPP。另外，还有9 个非常保守的半胱氨酸残基(图4)，而且达氏鲟gdf11与其他物种该基因编码的氨基酸序列的一致性较高，依次是腔棘鱼(88%)、青鳉(88%)、金头鲷(88%)、红鳍东方鲀(87%)、三刺鱼(87%)、绿河豚(86%)、斑马鱼(86%)、绿海龟(77%)、人(70%)和小鼠(70%)。

图4 达氏鲟及其他物种gdf11基因编码氨基酸序列的多重比对Fig.4 Multiple amino acids alignments of the gdf11黄线处为潜在的蛋白酶水解位点，红色三角处为半胱氨酸

2.4 达氏鲟gdf11在不同组织中的表达特征

为了分析gdf11的组织表达特异性，我们取常规养殖条件下达氏鲟8种不同组织cDNA为模板，分别扩增gdf11和β-actin基因进行Real-time PCR分析。结果表明，达氏鲟gdf11基因在所检测组织中均有表达。其中，在眼和鳃中的表达量较高，接着依次为脑、肝、肌肉和脾(图5)。

图5 达氏鲟gdf11基因的组织表达特征Fig.5 Analysis of the expression pattern of gdf11 in A. dabryanus

2.5 静水和流水作用下达氏鲟gdf11基因的表达情况

静水和流水对达氏鲟gdf11基因mRNA表达的影响如图6所示。由图可知，在肌肉、脑和肝中，静水和流水对达氏鲟gdf11基因mRNA的表达几乎没有影响。然而，在心和鳃中，静水和流水对达氏鲟gdf11基因mRNA的表达的影响较大。在静水中，鳃中gdf11基因mRNA的表达量是流水中的4.70倍，而心脏中gdf11基因mRNA的表达量是流水中的2.72倍(图6)。

图6 静水和流水养殖组中达氏鲟gdf11基因mRNA的表达差异Fig.6 Differential expression of Adgdf11 in static and flowing water C，静水组；V，流水组。

3 讨论

本研究克隆了鲟形目鱼类达氏鲟的gdf11基因cDNA，通过达氏鲟gdf11与其他脊椎动物gdf11蛋白的氨基酸序列比对，发现该基因十分保守。在N端都含有一个21aa的信号肽，同时都存在着一个潜在的蛋白水解位点；另外，gdf11蛋白C端的氨基酸序列非常保守，相似性能达到90%，并且还含有9个非常保守的半胱氨酸残基。这些结果表明，在进化过程中，该基因十分保守。

组织表达特征分析结果显示，gdf11在眼，脑和肌肉均有表达，这与其他脊椎动物的表达模式类似，表明该基因功能上的保守性。此外，我们发现gdf11在鳃中也有较高的表达量，为了进一步验证达氏鲟gdf11是否与呼吸代谢功能有关，我们设计了不同流速的养殖水体，分析达氏鲟在不同水流条件下gdf11的表达差异，结果显示鳃和心脏gdf11的表达量出现显著性差异(P<0.05)，静水中鳃gdf11基因mRNA的表达量是流水的4.70倍，而心脏中的表达量是流水的2.72倍。上述结果暗示达氏鲟gdf11很可能与心和鳃的呼吸和代谢功能有关，它们决定着氧气、能量输送。前期实验观察到水流组肌肉有氧代谢酶在流水组中显著高于静水组，流水组的静止耗氧率反而显著低于静水阻(杜浩，未发表数据)，推断流水组达氏鲟心、鳃对氧气的输运功能得到加强，从而抑制了gdf11基因的表达。鱼类的心脏和呼吸系统在水流训练情况下功能得到加强已经被一些研究证明[13]。大鳞大马哈鱼在水流训练中心脏指数如，心搏量增加、心率加快[14]。与之相适应的是血液循环加速、呼吸频率加快，鳃组织的气体流通量增加。本研究结果也可推断，gdf11基因对于心、鳃功能方面同样表现为负调控效应，流水组gdf11表达量的降低，促进了达氏鲟能量输运，代谢能力加强，从而使总体的能量消耗多于静水组。但该方面的具体功能机制仍需要进一步研究。

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(责任编辑：张潇峮)

Cloning and expression pattern of gdf11 cDNA in Acipenser dabryanus

DU Hao, LENG Xiao-qian, ZHANG Shu-huan, YE Huan, SHEN Li, LIU Zhi-gang, CHEN Xi-hua, WEI Qi-wei

(YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisheryScience，KeyLaboratoryofFreshwaterBiodiversityConservation，MinistryofAgriculture，Wuhan430223，China)

The full-length cDNA of thegdf11 (growth differentiation factor 11) gene fromAcipenserdabryanuswas cloned. Thegdf11 gene cDNA is 1 298 bp in size and has a 1 191 bp ORF (open reading frame) encoding a putative protein of 396 amino acid residues, and 5 and 3 non-coding region were 19 bp and 88 bp respectively. By Signal P prediction, it was found thatA.dabryanusgdf11 protein contained a 21 amino acid signal peptide. The RT-qPCR analysis showed thatgdf11 was existed in all the examined tissues, and it was expressed highly in the eyes and gills. Under different flow conditions, significant differences were found in thegdf11 expression level of the gills and heart, the expression ofgdf11 gene in the gill and heart ofA.dabryanusin the static water group is 4.70 times and 2.72 times of those in the flow enriched water group (27.0±3.0 cm/s). These impliedgdf11 might have functions in the respiratory metabolism.

Acipenserdabryanus；gdf11 gene；Gene cloning；Tissue expression pattern

2016-05-19；

2016-09-29

公益性农业行业专项(200903048)；国家自然基金青年基金项目(31202003)；中国长江三峡集团公司科技环保项目

杜 浩(1981- )，男，博士，副研究员，专业方向为濒危鱼类保护。E-mail: duhao@yfi.ac.cn

危起伟。E-mail: weiqw@yfi.ac.cn

S917.4

A

1000-6907-(2017)01-0030-05