HIF—1a、VEGF、MVD在大肠腺癌组织中的表达及临床意义

陈宝英+王泽辉+官成浓+张英+王玉洲

[摘要]目的探讨HIF-1a、VEGF、MVD（用抗CD34抗体标记）在大肠腺癌组织中的表达及与临床病理特征的关系。方法采用免疫组织化学S-P法检测广东医学院附属医院经病理检查证实的手术切除标本或活检组织中HIF-1a、VEGF、MVD的表达情况，其中38例大肠腺癌组织、22例大肠腺瘤组织、29例正常大肠组织。结果HIF-1a、VEGF在大肠腺癌组的阳性表达率分别为73.7%、65.8%，明显高于大肠腺瘤组、正常大肠组，差异有统计学意义（P<0.05）。大肠腺癌、大肠腺瘤、正常大肠组织中MVD值分别是（52.36±9.66）、（30.23±5.22）、（21.37±4.755），MVD值在腺癌中明显高于腺瘤及正常肠组织（P<0.05）。28例HIF-1a呈阳性表达的大肠腺癌组织MVD值为（53.22±10.15）；呈阴性表达的10例中MVD值为（42.75±10.47），呈正相关关系（rs=0.392，P<0.05）。VEGF呈阳性表达的25例大肠腺癌组织MVD值为（54.54±9.60）；呈阴性表达的10例中MVD值为（42.63±9.80），呈正相关关系（rs=0.491，P<0.05）。结论在大肠腺癌组织中HIF-1a和VEGF的表达明显高于大肠腺瘤组织和正常大肠组织，提示HIF-1a和VEGF可能参与大肠腺癌的发展。MVD值在大肠腺癌中的表达明显高于大肠腺瘤组织和正常大肠组织，提示大肠腺癌中血管生成较大肠腺瘤组织和正常大肠组织丰富；MVD值是衡量大肠腺癌发展、浸润及转移的重要指标。HIF-1a、VEGF的表达与MVD值在大肠腺癌组织中均呈正相关，提示HIF-1a、VEGF可能与大癌发展过程中血管生成密切相关。

[关键词]大肠腺癌；HIF-1a；VEGF；MVD

大肠癌包括结肠癌和直肠癌，是最常见的消化道恶性肿瘤之一。虽然目前对大肠癌采用了以手术切除为主的综合治疗，但其治疗效果仍不够理想，而术后的局部复发和远处转移则是影响术后生存率的重要因素。因此，深入研究大肠癌浸润和转移的可能机制，从分子水平找到可用于提示大肠癌转移和预后判断的分子标志物，既可预警大肠癌的术后复发、转移，及早对可能复发和转移的大肠癌患者进行放化疗或靶向治疗，亦可研究这些因子可否成为肿瘤治疗中的新靶点，对提高患者生存率、评估患者的预后及临床治疗有现实的意义。本课题运用免疫组织化学的方法检测HIF-1a、VEGF、MVD在大肠腺癌的表达情况，并分析其相关性，探讨它们与大肠腺癌临床病理参数间的关系及在大肠腺癌中与血管生成的关系，旨在对大肠腺癌恶性程度的判定、预后分析及生物学治疗提供有效的理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料

收集广东医学院附属医院经病理检查证实的手术切除标本或活检组织，其中大肠腺癌38例；正常大肠组织29例（距肿瘤边缘>5cm处的正常黏膜）；大肠腺瘤组织22例。所有标本均经40g/L缓冲中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋，每个标本蜡块行4μm厚度连续切片。所有患者手术前未接受放疗、化疗，每例有详细的临床资料、手术记录。38例大肠腺癌中男21例，女17例；年龄在29～84岁（其中≤60岁20例，>60岁18例，平均年龄59.42岁）；直肠癌16例，结肠癌22例；病理学分级：高分化5例，中分化25例，低分化8例；大肠腺癌TMN分期根据2002美国癌症联合会（AJCC）的分期标准进行分期：Ⅰ期6例，Ⅱ16期例，Ⅲ期15例，Ⅳ期1例；有淋巴结转移16例，没有淋巴结转移22例。

1.2实验方法

采用链菌素抗生物素蛋白一过氧化物酶法（S-P法）检测μm、VEGF、CD34蛋白的表达，一抗为兔抗人HIF-1a多克隆抗体（1：50），兔抗人VEGF多克隆抗体（1：50），兔抗人CD34多克隆抗体（1：50），试剂均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3结果判断标准

HIF-1a、VEGF表达水平采用Fromowitz阳性细胞半定量分级法。首先根据阳性细胞占整个肿瘤细胞的百分数记分：≤5%记为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。再根据阳性细胞染色深浅记分，阴性为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分，棕褐色为3分。最后将二者分数相加，0～1分记为（一），2～3分记为（+）；4～5分记为（++）；6～7分记为（+++），其中（-）～（+）视为阴性，（++）～（+++）视为阳性。

微血管计数参照Weidner的方法：任何与邻近的微血管、肿瘤细胞及其它相连组织有明显分界的被CD34染成棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇均视为一个血管计数，首先在低倍镜（40和100倍）下选取癌视野中微血管最密集的3个区域，然后在高倍镜（400倍）进行血管计数，取其平均值作为该例肿瘤的MVD值，结果以（x±s）表示。

1.4统计学方法

统计学处理在SPSS17.0软件包上进行。计数资料采用x²检验、计量资料采用t检验、方差分析，分析HIF-1a、VEGF、MVD在大肠腺癌、正常大肠组织、大肠腺瘤中的表达水平，以及它们与大肠腺癌的临床病理因素的相关性，用spearman等级相关分析HIF-1a、VEGF、MVD的相互关系，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1HIF-1a、VEGF和MVD在各种肠组织中的表达情况

2.1.1HIF-1a在各种肠组织中的表达情况HIF-1a阳性产物呈棕黄色或棕褐色颗粒，主要着色在细胞核和细胞浆，以细胞浆为主，在肿瘤坏死明显的区域和肿瘤浸润边缘的表达明显增多。在大肠腺癌、大肠腺瘤和正常大肠组织中均有表达，但表达程度不一。HIF-1a在大肠腺癌组织、大肠腺瘤组织、正常大肠组织中阳性表达率分别为：73.7%（28/38）、45.5%（10/22）、13.8%（4/29），在腺癌组织阳性表达率高于腺瘤组织和正常大肠组织，差异有统计学意义（P<0.05），在腺瘤组织与正常大肠组织间差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.1.2 VEGF在各种肠组织中的表达情况VEGF主要表达在细胞浆和细胞膜，以胞浆为主，某些血管内皮细胞也可见表达，呈棕黄色颗粒，大肠腺癌组织、大肠腺瘤组织和正常大肠组织中都有表达，但表达程度不一，高表达主要见于大肠腺癌组织。38例大肠腺癌组织中有25例VEGF表达阳性，占65.8%（25/38），VEGF在大肠腺瘤组织中阳性表达率为31.8%（7/22）及正常大肠组织中阳性率表达为10.3%（3/29）。VEGF在腺癌组织中的阳性表达率明显高于腺瘤与正常大肠组织（P<0.05），在腺瘤组织与正常大肠组织间差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.1.3CD34在各种肠组织中的表达情况CD34定位于血管内皮细胞膜上，呈棕黄色颗粒，主要分布于癌间质区，在肿瘤周边区含量相对高。在大肠腺癌中CD34标记的微血管形态多呈成熟状态，管腔大，管壁比较完整，在大肠正常组织中的微血管多为单细胞形成，管腔小，形状多不完整。大肠腺癌、大肠腺瘤、正常大肠组织中MVD值分别是（52.36±9.66）、（30.23±5.22）、（21.37±4.755）。MVD值在腺癌中明显高于腺瘤及正常肠组织（P<0.05），腺瘤组织与正常大肠组织间差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.2HIF-1a、VEGF和MVD的表达与大肠腺癌临床病理特征的关系

2.2.1HIF-1a的表达与大肠腺癌临床病理特征的关系HIF-1a在大肠腺癌中的表达与TNM分期、淋巴结转移、肠壁浸润深度相关，Ⅲ期+Ⅳ期阳性表达率高于Ⅰ期+Ⅱ期（P<0.05），淋巴结转移阳性组高于淋巴结转移阴性组，肿瘤浸润达浆膜及浆膜外组阳性表达率高于肿瘤浸润未及浆膜组；HIF-1a表达与年龄、性别、肿瘤最大直径、肿瘤部位、病理学分级无关（P>0.05）。见表4。

2.2.2 VEGF的表达与大肠腺癌临床病理特征的关系VEGF在大肠腺癌中的表达与TNM分期、淋巴结转移、病理学分级差异有统计学意义（P<0.05），分期晚VEGF阳性表达率高，淋巴结转移阳性组高于淋巴结转移阴性组，低分化VEGF阳性表达率高于中分化和高分化组；VEGF表达与年龄、性别、肿瘤最大直径、肿瘤部位、肠壁浸润深度无关（P>0.05）。见表5。

2.2.3MVD的表达与大肠腺癌临床病理特征的关系MVD值与大肠腺肠癌TNM分期、淋巴结转移、肠壁浸润深度差异有统计学意义（P<0.05），分期晚MVD值高，淋巴结转移阳性组高于淋巴结转移阴性组，肿瘤浸润达浆膜及浆膜外组高于肿瘤浸润未及浆膜组，低分化组高于中分化和高分化组；与年龄、性别、肿瘤最大直径、肿瘤部位无关（P>0.05）。见表5。

2.3大肠腺癌组织中HIF-1a、VEGF和MVD表达的相互关系

28例HIF-1a呈阳性表达的大肠腺癌组织MVD值为（53.22±10.15）；呈阴性表达的10例中MVD值为（42.75±10.47），呈正相关关系（rs=0.392，P<0.05）。VEGF呈阳性表达的25例大肠腺癌组织MVD值为（54.54±9.60）；呈阴性表达的10例中MVD值为（42.63±9.80），呈正相关关系（rs=0.491，P<0.05）。见表6。

3讨论

本实验发现HIF-1a在大肠腺癌组织中表达水平为73.7%（28/38）明显高于大肠腺瘤组织45.5%（10/22）、正常大肠组织13.8%（4/29），差异有统计学意义（P<0.05），尤其是在肿瘤坏死明显的区域和肿瘤浸润边缘。这提示HIF-1a的高表达与大肠腺癌的发生有相关性，这与国内外大多数相关报道基本一致。其表达水平增高可能是因为肿瘤组织氧浓度降低，也可能是抑癌基因突变或癌基因激活，从而导致一系列基因的表达水平增高，使肿瘤细胞耐受缺氧，促进肿瘤生长、浸润、转移。另外HIF-1a表达与淋巴结转移有关，有淋巴结转移的大肠腺癌HIF-1a的阳性表达率为93.8%（15/16）高于无淋巴结转移组59.1%（13/22）；在肿瘤肠壁浸润达浆膜或浆膜外组HIF-1a的阳性表达率为86.2%（25/27）高于肠壁浸润未达浆膜层组的45.5%（5/11）；在大肠腺癌Ⅰ～Ⅱ和Ⅲ～Ⅳ病例中，HIF-1a的阳性表达率分别是59.1%（13/22）、93.8%（15/16），差异均有统计学意义（P<0.05）。提示HIF-1a表达异常与腺癌的淋巴结形成、肠壁浸润深度及临床分期有关，而且肿瘤肠壁浸润越深、TNM分期越晚阳性表达率越高；HIF-1a的表达与患者性别、年龄、病理学分级、肿瘤部位、肿瘤大小无关（P>0.05）。Schindl等对206例淋巴结转移阳性的乳腺癌标本的HIF-1a表达进行免疫组化分析，显示HIF-1a阳性表达率为76.2%（157/206），也提示HIF-1a是高度侵袭性疾病的一个生物标志。本研究提示肿瘤细胞通过增强HIF-1a表达，促进肿瘤的生长和浸润转移。其可能的机制为HIF-1a调节VEGF的表达，VEGF进而作用于存在于血管内皮细胞表面的两种受体VEGFR1和VEGFR2，从而激活了一系列的缺血转导通路，诱导新生血管的生成，增高毛细血管通透性，来促进肿瘤的生长和浸润转移。

本研究发现在38例大肠腺癌组织中VEGF的阳性表达率为65.8%（25/38）明显高于腺瘤组织31.8%（7/22）和正常大肠组织10.3%（3/29），差异有统计学意义（P<0.05），提示VEGF高表达可能与大肠腺癌的发生有一定相关性。这与国内外相关报道基本一致。本实验还分析了VEGF表达与大肠腺癌临床病理学及其相关因素的关系，在大肠腺癌组织中VEGF的表达与患者性别、年龄、肠壁浸润深度、肿瘤部位、肿瘤大小无关（P>0.05）。与大肠腺癌的淋巴结形成、病理学分级及临床分期有关，在无淋巴结转移组和有淋巴结转移组中，VEGF的阳性表达率分别是50.0%（11/22）、87.5%（14/16）；在病理分级高分化、中分化及低分化组中VEGF的阳性表达率分别是20.0%（1/5）、68.0%（17/25）、87.5%（7/8）；在Ⅰ～Ⅱ组和Ⅲ～Ⅳ组病例中，VEGF的阳性表达率分别是50.0%（11/22）、87.5%（14/16），差异均有统计学意义（P<0.05）。提示大肠腺癌组织中VEGF的表达明显增高且与肿瘤的侵袭能力密切相关。VEGF是一种内皮细胞特异性有丝分裂原，能促进内皮细胞外基质溶解、内皮细胞迁移、增生和管腔形成，能直接刺激新生血管形成；VEGF还能增加血管尤其是微血管的通透性，为血管形成过程中多种细胞迁移提供一个纤维网络，部分肿瘤细胞也可以穿过血管壁进入血管向远处转移，加速了肿瘤浸润和转移；VEGF亦可上调或诱导各种血管源因子和抗凋亡因子，促进肿瘤血管生成并提高肿瘤细胞的抗凋亡能力。

本实验中，在38例大肠腺癌中，MVD值为52.36±9.66，在22例大肠腺瘤中MVD值为30.23±5.22，而29例大肠正常组织中MVD值为21.37±4.75，差异有统计学意义（P<0.05）。这与其他研究者对乳腺癌、肺癌、前列腺癌、子宫鳞癌等肿瘤组织MVD检测的结果一致，这说明大肠腺癌组织的血管生成能力明显增强。本实验还分析了MVD值与大肠腺癌临床病理学及其相关因素的关系，在大肠腺癌组织中MVD值与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小无关（P>0.05）；而在无淋巴结转移组和有淋巴结转移组中，MVD值分别是（44.97±10.00）、（58.02±7.75）；在肿瘤肠壁浸润达浆膜或浆膜外组MVD值为55.09±9.24高于肠壁浸润未达浆膜层组的（39.13±6.06）；在病理分级高分化、中分化及低分化组中MVD值分别是（43.12±13.19）、（49.20±8.90）、（59.00±12.47）；在Ⅰ～Ⅱ组和Ⅲ～Ⅳ组病例中，MVD值分别是（44.97±10.00）、（58.02±7.75），差异均有统计学意义（P<0.05）。MVD值与大肠腺癌的淋巴结形成、肠壁浸润深度、病理学分级及临床分期有关，可能因为肿瘤的快速生长，使其处于相对缺氧的状态，促使了大肠腺癌血管新生，维持了肿瘤生长，同时新生的肿瘤血管又加速了肿瘤的浸润和转移。因此说明血管生成在大肠腺癌的发生、发展过程中起到重要作用。

研究已证实VEGF是刺激肿瘤血管形成最关键的生长因子，其表达受许多外部因子调控，HIF-1a为其中之一，有研究表明HIF-1a可上调多种血管生成因子的表达来介导缺氧状态下的血管形成反应，可介导VEGF和其他缺氧反应基因的转录活性。大量的研究证明HIF-1与VEGF存在正相关关系，Bos等研究表明在乳腺癌的形成中，HIF-1a的表达与血管内皮细胞生长因子VEGF的表达、肿瘤细胞的高增殖状态呈正相关，认为HIF-1a可作为乳腺癌患者新的预后指标之一。本实验与国内外的研究相一致。

本实验研究发现HIF-1a、VEGF均与MVD值存在正相关关系。提示两种因子均可通过各种的信号传导通路促进大肠腺癌血管的生成，并与大肠腺癌的发生、发展与侵袭转移密切相关。因此深入研究HIF-1a可能将为大肠腺癌的放化疗及基因治疗提供新的靶点。