碳点的研究进展

木合塔尔?吐尔洪+徐阳+尹学博

摘 要 碳点具有优良的光学特性＼，良好的生物相容性和低毒等优点， 被广泛用于生物检测、药物传输和生物成像等领域， 是极具发展潜力的碳基质材料。近年来， 碳点的新型制备方法、性质探索及应用研究引起广泛关注。本文根据碳源和制备方法的不同， 将碳点分为石墨烯纳米点和碳纳米点两类， 综述了碳点的制备方法， 剖析了碳点的发光机理， 总结了碳点在生物传感、药物传输和生物成像中的应用； 最后分析了碳点存在的问题及应对策略。

关键词 碳点； 合成方法； 发光机理； 生物传感； 生物成像； 综述

1 引 言

碳点（Carbon dots， Cdots）是指粒径小于10 nm的新型荧光碳纳米材料， 因其主要元素为碳、氢、氧和氮， 不会发生重金属泄漏， 有望成为重金属半导体量子点的理想替代材料[1]。由于Cdots具有荧光活性高、种类多样、生物相容性好、毒性低等优点， 在生物检测[2]、基因转运[3]、药物传输[4～8]和生物成像[9，10]等领域得到了广泛应用。碳点优良的荧光性能已在分析化学领域中展现出重要的应用潜力[2，10～16]。

2004年， Xu等[17]在分离纯化碳纳米管时， 发现具有荧光性质的组分并证实其主要成分为碳。通过原子力显微镜证明了其纳米尺寸， 掀起了人们研究碳点的热潮。图1展示了碳点发展过程中一些重要事件： Sun等[18]使用硝酸回流氧化蜡烛灰得到了碳点， 通过PEG钝化提高了碳点的荧光产率， 推动了碳点由新奇到实用的发展。Liu等[19]通过凝胶分离得到不同发光颜色碳点， 开启了碳点发光机理的研究。Zheng等[20]通过电化学剥离方法制备碳点并研究了碳点的电化学发光。上述研究通过物理或化学方法剥离或切割得到碳点， 即Top.down策略。微波、水热等合成方法快速发展丰富了碳点的制备方式。Liu等[21]通过水热方法碳化硅球表面有机分子获得碳点， 碳点的制备进入了Bottom.up的阶段， 即由有机小分子、生物分子， 甚至Biomass制备碳点。微波合成技术的引入， 将碳点制备由几小时缩短到几分钟[22]。Zhu等[23]通过水热方法制备碳点， 讨论了碳点的形成机理及传感， 多色成像应用等。

本评述根据碳点制备方法及碳源的不同， 将碳点分为石墨烯纳米点及碳纳米点， 介绍了两类碳点的制备方法， 讨论了碳点发光性质， 剖析了碳点发光机理， 总结了碳点在生物传感、药物传输和生物成像中的应用。

2 碳点的合成

碳点制备方法主要有两类： 以石墨类材料为基础的Top.down方法和以有机分子为原料的Bottom.up方法（图2）。碳点也因此被称为石墨烯纳米点（Graphene nanodots）和碳纳米点（Carbon nanodots）等。

2.1 石墨烯纳米点

石墨烯纳米点是指将石墨、碳纳米管、碳纤维、氧化石墨烯和有机质高温碳化产物等进行化学或物理剪切， 得到小于10 nm的纳米粒子[24，25]。石墨烯纳米点由碳六元环蜂窝状片层相互重叠形成的类石墨烯多层结构， 原子层数一般小于5， 且原子层边缘含有羧基、羰基和羟基等官能团， 便于后续功能化。

Sun等[18]利用氧化钝化法对蜡烛灰氧化剪切得到石墨烯纳米点， 与PEG.1500N通过酰胺键钝化， 证明了表面结构对于碳点荧光效率的重要性。碳点钝化改善荧光性质， 得到了广泛关注， 并影响了后续合成方法的设计[26～28]。Peng等[29]使用H2SO4.HNO3回流， 使碳纤维沿Zigzag轴裂解得到石墨烯纳米点。Kwon等[30]采用HNO3.十八烯胺/肼两步剪切法， 成功制备了单分散石墨烯纳米点， 并用于白光LED元件的制备。Dong等[31]使用强酸氧化法制备了分子量不同， 荧光由绿到红的石墨烯纳米点， 并发现氧化型石墨烯纳米点的强电化学发光能力。Dong等[32]使用HNO3氧化CX.72炭黑分别得到单层和多层石墨烯纳米点。Li等[33]采用微波加热合成了绿色荧光石墨烯纳米点。Luo等[34]使用两步微波反应制备白光碳点。

电化学方法可以通过改变电位调控碳点的性质。Bao等[35]采用电化学剥离方法制备碳点， +0.5～+2.5 V不同电位得到了不同粒径及发光性质的碳点。Lu等[36]使用离子液体为溶剂， 通过电化学石墨剥离得到了蓝色荧光的石墨烯纳米点。Zhou等[37]通过电化学方法从多壁碳纳米管中得到了粒径约2.8 nm的蓝色荧光碳纳米晶体。Tan等[38]在K2S2O8溶液中对石墨进行电解（+5 V）制备了红光碳点。

Pan等[39]对石墨烯进行酸化—水热处理得到石墨烯纳米点。Tetsuka等[40]改进了水热方法， 使用氧化石墨烯/氨水混合溶液获得荧光可控的氨基化石墨烯纳米点。依据这个思路， 通过简单水热方法可以合成多种石墨烯纳米点。 此外， Ponomarenko等[41]通过实验证明， 利用电子束刻蚀大片石墨烯得到了细小的石墨烯纳米点。因此， 石墨烯纳米点可以简便的方法制得，提高了合成效率[42～44]。

2.2 碳纳米点

碳纳米点是以糖、柠檬酸和氨基酸等有机小分子为碳源， 通过官能团偶联实现分子间聚合， 即Bottom.up方法形成的碳纳米材料。人们发现鸡蛋清[45]、草[46]、柚子皮[47]、蚕丝[48，49]等也可作为合成碳纳米点的原料。碳纳米点的合成方法主要有水热法， 超声法， 微波加热以及中和热法等[23，45，49～56]。

水热法是广泛使用的纳米材料合成手段， Shin等[57]合成70～150 nm的碳球， 通过检测水热过程碳球的核磁信号， 解释了水热反应原理。Yang等[58]以葡萄糖胺为碳源， 一步水热合成了荧光碳纳米颗粒。在此基础上， 他们加入磷酸盐作为催化剂， 分别得到蓝、绿两种荧光碳纳米点[59]。由于水热反应是在高温高压状态下进行， 鸡蛋清[45]、草[46]、柚子皮[47]、蚕丝[48，49] 等生物质也成为合成碳纳米点的碳源。

本研究组设计了简便、绿色的碳化—溶剂萃取法直接制备高荧光效率碳点， 以左旋多巴、精氨酸等含氮化合物为碳源， 实现无需二次分离制备低氧化程度、高荧光效率的氮掺杂碳点[53]。Li等[60]超声葡萄糖合成了荧光碳纳米点。Ma等[61]将这种方法进行拓展， 使葡萄糖在氨水环境下超声制备氮掺杂碳点。Zhu等[22]利用微波加热合成了荧光碳纳米点。Chandra等[62]在微波加热的基础上引入磷酸， 提高糖类化合物的碳化效率。此外， 采用多种碳源如牛奶也可以通过微波的方法制备碳点[63]。

以上碳点的制备方法需要较高温度和能量， 需要外部供能装置。本研究组利用中和反应放热的原理设计了无需外部热源， 一步超快速（合成时间2 min）合成强荧光碳点的新方法[50]。该方法适用于葡萄糖， 柠檬酸以及多巴胺等多种碳源[50，52]。因对碳源碳化不完全， 碳点仍保留有碳源的官能团， 从而使碳点拥有与碳源类似的特性， 有望实现生物分子模拟碳点制备， 拓展碳点的应用范围。

3 碳点的发光机理

碳点显示激发依赖的荧光特性， 这种不同于其它发光材料的荧光特性引起了广泛关注。制备单色荧光碳点， 研究碳点荧光机理是提高碳点应用性的重要研究方向； 研究碳点的电化学发光， 对于拓展碳点的分析应用具有很好的研究和实用价值。碳点发光机理较主流的观点有量子尺寸效应、表面态、以及电子空穴和辐射重排等。

3.1 量子尺寸效应

量子尺寸效应是指当粒子的粒径下降至纳米级时， 费米能级附近的准连续电子能级变为离散能级的现象。因此， 纳米材料， 特别是粒径小于10 nm的材料， 显示与块状材料明显不同的光学性质。Li等[64]使用电化学方法制备碳点， 结合柱色谱分离得到不同碳点的组分， 发现不同组分碳点粒径不同， 1.2 nm的碳点发紫外光， 1.5～3.0 nm发可见光， 3.8 nm发近红外光[64]。表明粒径增大， 碳点带隙间距减小（图3A）。Kim等[65]也发现碳点的吸收光谱和荧光光谱受粒径调节（图3B）。Bao等[66]证明了碳点的最大荧光发射波长随分子量增大而红移。然而并不是所有碳点都能观察到类似现象， Ding等[67]通过对苯二胺与尿素水热制得的碳点进行硅胶柱分离， 发现4种组分平均粒径均为2.6 nm， 而荧光颜色却分别为蓝、绿、黄、红。

3.2 表面态和官能团机理

碳点的表面官能团是影响表面能级和能级间距的重要因素。Sun等[18]使用PEG.1500N钝化碳点而提高荧光产率。后续工作也证明碳点表面钝化对于改善碳点荧光性质的重要性[68，69]， 如十八烷胺作为钝化剂增强了碳点的荧光[68]。含氮有机物有效钝化碳点表面而提高碳点的荧光效率（图3C）[70]。理论计算证明了碳点表面修饰NH2基团可以引起荧光发射的红移； 修饰NH2数目在1～6个时， 碳点的带隙间距会随修饰基团数目的增多而减小（图3D）[71]。

图3 碳点的光学性质及发光机理。（A）荧光发射波长随粒径变化示意图[64]。（B）碳点的紫外吸收与粒径的变化关系图[65]。（C）碳点表面官能团影响能级变化示意图[70]。（D）带隙间距与氨基数目的关系[71]。（E）不同氧化程度的碳点对带隙间距 [72]。（F）蓝色荧光和绿色荧光碳点通过氧化还原反应进行转化[73]。（G）氧化程度对碳点荧光的影响[35]。（H）碳点荧光随结构的变化[74]。（I）低氧化态碳点与（J）高氧化态碳点的TEM表征图（标尺为5 nm） [53]。（K）N， S掺杂对碳点荧光机理示意图[77]Zhu等[72]发现碳点氧化程度不同会导致荧光颜色的变化（图3E）。硼氢化钠还原调控碳点表面状态可增强碳点荧光产率至24%（图3F）[73]。Bao等[35]发现电化学氧化制备的碳点表面氧化程度不同， 氧化程度低的碳点发蓝色荧光， 而氧化程度高的碳点发绿色荧光（图3G）。Lingam等[74]通过对比石墨烯纳米点、碳纳米材料和碳纳米洋葱的结构和荧光性质， 证明了石墨烯纳米点的边界态荧光（图3H）。Feng等[75]使用肼还原增强了碳点的荧光。Hola等[76]使用没食子酸作为碳源合成碳点， 探讨氧化程度对碳点荧光发射波长的影响。本研究组通过TEM表征发现低氧化态碳点主要由致密的碳晶核构成（图3I）， 而高氧化态碳点由碳晶核和外部的疏松氧化层组成（图3J）， 且结构和表面态的差异导致不同的荧光性质[53]。

3.3 电子空穴和辐射重排理论

电子空穴和辐射重排理论主要用于氮、硫等杂原子掺杂碳点的荧光机理解释。本研究组认为氮原子在碳点中提供能级， 才可以引起辐射重排， 提高荧光效率[53]。Dong等[77]对氮、硫共掺杂碳点的发光机理研究发现， 氮掺杂产生了新的表面态能级， 电子的能级束缚产生辐射重排， 增强碳点的荧光效率； 硫原子的引入同样会促进辐射重排（图3K）。

与上述将3种机理分开考虑不同， 本研究组认为在光子激发下， 碳点碳核中的电子受激发从价带（VB）迁移至导带（CB）， 这是纳米尺寸效应的结果。由导带回到价带的辐射经表面缺陷的非辐射重排产生荧光， 对应着表面结构对荧光性质的影响[78]。因此， 表面结构作为非辐射重排中心降低荧光效率的和发射波长的红移[29～32，41]， 因而解释了碳点大的斯托克位移， 氧化程度对碳点荧光发射光谱的影响及其电化学发光现象。当施加电势超过阈值时， 在碳点表面层形成自由基[22，33]， 在共反应剂作用下， 自由基湮灭放出光子， 即电化学发光。荧光与电化学发光的过程不一样， 所以碳点的荧光和电化学发光的发射波长也可能不同[79]。

上述单光子荧光检测速度快， 仪器要求低， 但组织穿透能力差， 且激发光能量大对组织光损伤能力强。双光子荧光即发光材料吸收两个长波长光子激发电子跃迁至激发态， 在返回基态时释放出波长小于激发波长的光子， 因此也称为上转换荧光， 并且克服单光子荧光的某些缺点[80]。PEG包覆碳点在880 nm激发下获得了绿色荧光成像图， 表明了碳点双光子成像的应用潜力[69]。但Gan等[81]使用640 nm氙灯对石墨烯纳米点照射， 没有得到上转换荧光。探讨碳点双光子荧光理论， 研究双光子荧光碳点的结构， 进而提高碳点双光子荧光效率是未来发展的一个方向。

4 碳点的应用

4.1 碳点在生物传感方面的应用

研究者利用碳点的荧光性质及其表面功能基团构建了多种生物/化学传感器。以检测检测Hg2+及生物硫醇为例（图4A）[47]， Hg2+通过表面配位重组碳点中的电子和空穴， 导致碳点的荧光猝灭； 但巯基与Hg2+的强结合能力可以恢复Hg2+猝灭碳点的荧光， 实现“Turn.off”方式检测Hg2+， “Turn.on”模式检测生物硫醇。Dong等[82，83]制备了支链聚乙烯亚胺（BPEI）修饰碳点（图4B）， 利用Cu2+与氨基的螯合作用实现能量共振转移猝灭碳点荧光， 河水中Cu2+的检测限为6 nmol/L。

鉴于Cu2+对碳点荧光的猝灭效果， 研究者将其用于细胞中Cu2+的检测。Zhu等[84]制备了AE.TPEA.碳点.CdSe/ZnS纳米点复合材料， 实现对Cu2+的荧光比率型检测， 并用于探测细胞中Cu2+的位置（图4C）。Vedamalai等[85]同样制备了对Cu2+敏感的碳点实现细胞中Cu2+的检测。

碳点.还原氧化石墨（Cdots@RGO）复合材料可用于乙酰胆碱检测（图4D）[86]： 乙酰胆碱酯酶可以将乙酰胆碱转化为胆碱， 而胆碱可以在胆碱氧化酶存在条件下生成H2O2。利用H2O2猝灭碳点复合物的荧光实现乙酰胆碱的定量检测， 检测限为30 pmol/L。此外， 碳点.Ag， Au形成Cdots.Ag/Cdots.Au纳米复合材料可用于生物活性物质的检测[87～89]， 对H2O2及葡萄糖的比色检测的检出限分别为0.18和1.6 μmol/L [87]； 利用金纳米粒子与谷胱甘肽结合实现谷胱甘肽的荧光.比色双模态检测， 检测限达到50 nmol/L[88]。Zhang等[90]将硼酸修饰到碳点上， 利用硼酸与葡萄糖的强亲和能力， 实现了碳点对葡萄糖的检测， 检测限为0.03 nmol/L（图4E）。本研究组以葡萄糖为碳源通过中和热法合成碳点 [50]， 由于葡萄糖未被完全碳化， 其表面邻羟基与硼酸进行结合， 从而实现对糖蛋白的检测。

碳点还用于构建化学发光和电化学发光的生物传感器。Lin等[91]利用碳点在过氧亚硝酸存在条件下产生的化学发光， 实现了碳点化学发光检测亚硝酸盐（图4F）。Shao等[92]使用Cdots.TPEA电化学响应实现对小鼠大脑中的Cu2+的追踪扫描。Li等[33]通过微波法合成了石墨烯纳米点， 利用羧基官能团与Cd2+螯合的特点， 建立了检测Cd2+的电化学发光检测器， 检测限达到13 nmol/L（图4G）。

4.2 碳点在药物传输和基因转运中的应用

酰胺缩合反应制备的叶酸修饰碳点可以实现对癌细胞的靶向识别[93]， 为发展基于碳点的细胞筛选和诊断提供了思路。PEI修饰碳点表面带正电， 因而可以吸附带负电的DNA， 用于基因转运[3]。Liu等[3]评估了碳点的转运能力， 发现碳点具有与带正电的PEI.25K相似的DNA转运能力， 但碳点的荧光可以示踪质粒DNA在转运过程中的分布， 为研究质粒DNA的生理作用提供依据。碳点.DNA复合物转染3 h后可以进入细胞。通过405， 488和543 nm激光的照射分别产生蓝、绿和红光， 说明碳点在转运过程仍然保持其多色荧光性质。

Lai等[4]制备了聚乙二醇（PEG）修饰碳点并实现了阿霉素（DOX）的装载和递送。荧光成像表明阿霉素在细胞内的释放过程： 细胞液中主要显示碳点的绿色荧光， 细胞核内可以观察到阿霉素的红色荧光， 说明阿霉素由碳点转运至细胞， 然后释放并进入到细胞核， 达到治疗的效果。Chowdhuri等[6]将碳点与金属有机骨架结构（MOFs）结合， 实现药物传输。Wang等[8]将壳聚糖.聚乙二醇包覆碳点形成复合水凝胶， 实现pH/近红外光控制药物释放。上述研究初步验证了碳点的相关应用， 有助于研究碳点在体内的变化及其核膜通透性等问题， 推动碳点的临床应用。

4.3 碳点在生物成像中的应用

4.3.1 体外成像 体外成像是以细胞作为研究对象， 评价探针成像能力和毒性， 了解探针进入细胞的方式， 研究探针分布和细胞毒性的手段。碳点已成功用于多种细胞的转染成像， 如HeLa[5，10，11，53，62，94，95]、人神经干细胞[96]、4T1[97]、NIH.3T3[98]、A549[49，85]和HepG.2[53]等。碳点主要通过内吞进入到细胞且主要集中于细胞液中， 鲜有碳点进入细胞核的报道[53]。Zhu等[99]使用溶剂热法制备了绿色荧光碳点， 成功应用于细胞成像， 证明了其低的细胞毒性（图5A）。本研究组发现碳化.萃取法制备的氮掺杂碳点具有激发依赖特性， 在细胞水平上实现了多色荧光成像[53]。碳点的表面修饰有助于开发靶向性多功能生物探针。Tang等[7]在碳点表面修饰叶酸和阿霉素， 实现了对癌细胞的特异性识别、药物运输和荧光成像（图5B）。Bhunia等[95]合成了一系列从蓝光到红光荧光发射碳点， 并通过碳点表面修饰叶酸达到靶向识别效果。Choi等[5]通过修饰叶酸和锌酞菁， 使碳点不仅具有靶向能力， 而且还可以进行光热治疗（图5C）。本研究组以多巴胺为前驱体， 利用快速中和热方法制备了生物分子模拟碳点， 该碳点保留有多巴胺的功能基团， 因而可以巧妙“骗过”核膜进入细胞核， 实现细胞核染色（图5D）[52]。

使用近红外光激发（800～900 nm）实现碳点的双光子细胞成像有助于消除细胞自体荧光的干扰[100]。Yang等[69]在880 nm激光的激发下获得了绿色荧光成像图。Zhang等[80]使用C3N4纳米点实现了细胞核的双光子成像。Kong等[100]制备了pH敏感碳点纳米传感器， 利用碳点的双光子荧光实现了活细胞和组织成像。

4.3.2 体内成像 斑马鱼具有明确的生长周期， 因而广泛应用于疾病发展、生长机理和药物筛选等基础医学研究[101]。斑马鱼光通透性能强， 便于碳点荧光成像。本研究组研究了多种碳点的斑马鱼荧光成像， 发现碳点主要沉积在斑马鱼的眼部及卵黄囊[50，102，103]（图6）。碳点荧光可以在斑马鱼体内保持60 h， 便于对斑马鱼胚胎发育过程的观测[102]。

PEG碳点和ZnS掺杂C ZnS.dots.PEG碳点成功用于小鼠成像， 获得了绿色和红色荧光成像结果（图6）， 且对组织和脏器没有毒副作用[9]。通过皮下前足注射PEG碳点可以转移至淋巴节， 实现小鼠淋巴节荧光成像， 可能是PEG修饰所致， 发现碳点的转移速度慢于纳米点[9]。静脉注射1 h后碳点转移至膀胱部位。经过4 h， 器官中的荧光信号变弱， 但解剖发现肾脏中碳点含量较高， 说明碳点是通过尿液排出[9]。Tao等[104]使用不同波长激光照射（455～704 nm）， 实现小鼠的体内成像。Li等[105]使用蓝光碳点对昆明鼠进行成像， 发现碳点可以通过血脑屏障进入到脑部。

5 结论与挑战

改善碳点的光学性质， 提高荧光效率， 发展红色荧光碳点是其基础研究的重点； 实现碳点多功能化， 发展碳点生物分子标记， 对于推动碳点由验证到实用、由新奇到应用具有重要意义。碳点荧光主要集中在蓝绿光， 仅有少量红光及近红外荧光碳点的报道且发光效率较低[106]。制备低背景荧光碳点可以从以下几个方面考虑： （1）选择合适碳源以改善碳点发光性质， 如Jiang等[107]通过调控苯二胺类化合物氨基位置得到红光碳点。Ge等[108]通过使用聚噻吩为碳源， 将碳点荧光红移至650～700 nm； （2）选择合适的钝化剂有助于增强碳点荧光； （3）杂原子的引入可以改变碳点带隙间距， 调控碳点的产率和荧光发射范围。

碳点表面含羧基和氨基[1]， 可以通过酰胺缩合与功能分子偶联。但碳点与修饰物之间的能量共振转移可能导致碳点荧光蓝移和猝灭。因此从修饰方面需要考虑： （1）修饰方法的选择。如， 选择合适桥联物（如硅球， 无机粘土等）增加碳点与修饰物间的距离， 降低能量共振转移的影响； （2）多模态功能化。考虑引入多模态成像因子， 构建多模态成像碳点。如Bourlinos等[109]使用钆喷酸为钆源， 与三羟甲基氨基甲烷和甜菜碱一锅法制备了粒径为3～4 nm的Gd掺杂碳点。 本研究组利用金属与有机化合物的螯合特性， 制备了碳点.Gd复合材料， 以小鼠模为模型， 验证了其荧光/磁共振双模态应用[110]。

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Abstract Carbon dots （Cdots） become potential material for biosensing， drug delivery， and bioimaging because of their excellent optical properties， high biocompatibility， and low toxicity. The preparation， properties， and applications of Cdots have drawn great attention. In this review， we classify Cdots into two groups： graphene nanodots and carbon nanodots based on the difference in precursors and preparation methods. The synthetic methods of Cdots are summarized and their luminescence mechanism is analyzed. The applications of Cdots in biosensing， drug delivery， and bioimaging are also discussed. The issues and challenges of Cdots are analyzed for their further development.

Keywords Carbon dots； Synthesis method； Luminescence mechanism； Biosensing； Bioimaging， Review