自组装有序纳米银线表面增强拉曼光谱检测牛奶中三聚氰胺

赵蕊池+王培龙+石雷+苏晓鸥

摘 要 制备具有表面增强拉曼散射（SERS）增强效果的基底是获得灵敏SERS检测的基础。本研究以多元醇法合成、流体流动法组装制备的有序纳米银线作为三聚氰胺的SERS增强基底，实现了样品中痕量三聚氰胺的快速灵敏检测。通过理论计算及实验考察得到了三聚氰胺的拉曼特征峰，优化了三聚氰胺在有序纳米银线基底上的SERS检测条件。在pH=8、水为溶剂、溶剂挥发时间为14 min的最佳条件下，三聚氰胺特征峰强度与浓度在0.05～1.00 mg/L范围内呈现良好的线性关系，其线性相关系数R=0.997，检测限为0.05 mg/L。在牛奶中添加不同浓度的三聚氰胺，其回收率为89.7%～109.2%，相对标准偏差低于6.8%。本方法对三聚氰胺检测具有很好的灵敏度和稳定性，为其它小分子化合物的SERS检测提供技术支持。

关键词 有序纳米银线； 三聚氰胺； 表面增强拉曼散射

1 引 言

三聚氰胺（Melamine，C3N3（NH2）3），是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，由于其氮含量高（66.6%）常被非法添加到牛奶和各种乳制品中[1]。三聚氰胺难以代谢，动物或人食用后会产生不同程度的肾衰竭，严重的甚至导致死亡[2]。2011年，我国农业部第10号公告规定，三聚氰胺在婴儿配方食品中用量不得超过1 mg/kg，在其他食品中亦不得超过2.5 mg/kg[3]。因此，研究开发简单、快速并且高灵敏检测食品中三聚氰胺的技术十分必要。

目前，三聚氰胺的检测手段主要有质谱法（MS）[4]、高效液相色谱法（HPLC）[5]、气相色谱法（GC）[6]、电化学法[7]和酶联免疫吸附法（ELISA）[8]等。上述方法虽然有很高的灵敏度和准确性，但大多数存在检测周期长、技术要求高、仪器造价昂贵和样品前处理繁琐等不足[9]，因此很大程度上限制了这些技术的实际应用。

表面增强拉曼光谱（SERS）分析技术是以拉曼散射效应为基础建立起来的一种分子结构表征技术。当一些分子被吸附到某些粗糙的金属表面时，拉曼信号的强度会增加104～106倍，这种现象称为表面增强拉曼散射[10，11]。SERS信号强度与其增强基底材料有关。目前应用比较多的增强基底主要以银、金、铜3种金属材料为主，其中银的增强活性最好[12]。例如，Li等[13]以包裹在SiO2外壳上金粒子为SERS增强基底检测牛奶中的三聚氰胺，检测限为1 mg/L； Zhang等[14]以银胶体为SERS增强基底，其牛奶中三聚氰胺的检出限低至0.5 mg/L。纳米银线作为一种新兴材料，将其作为SERS增强基底已成功地用于药品中药物成分的定量分析[15]。常见的纳米银线制备方法有模板法[16]、晶种法[17]、水热法[18]和多元醇法[19]等。其中，多元醇法操作简单、原料易得、反应体系环保易控，因此受到了科研工作者的青睐。很多研究表明，纳米银线呈有序排列能够有效增强SERS的检测信号，且信号重现性较好[20，21]。

本研究采用多元醇法合成、流体流动法组装、制备有序纳米银线，并将其应用于三聚氰胺的SERS检测。其有序纳米银线基底大大增强了牛奶中三聚氰胺的SERS检测信号，有效克服了常用SERS增强基底（如银或金纳米溶胶）重现性和稳定性较差、分析结果精确度低的不足，使用此基底对三聚氰胺进行定性与定量分析，具有简单、快速、准确和灵敏度高的特点，可为乳制品的检测提供技术支持。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

RamTracer@.200.HS型便携式拉曼光谱仪（美国Opto Trace公司）；S.4800冷场发射扫描电子显微镜（日立高新技术株式会社，上海）；XRD粉末衍射仪（Rigaku Dmax.2500）；48孔正压固相萃取装置（J2，美国）；TARGINTM VX.Ⅲ型多管涡旋振荡器；明澈TM.D 24UV型超纯水制备器（美国Millipore公司）；3K15型高速离心机（美国Sigma公司）；KQ5200DB型数控超声波清洗仪；MG.2200型氮吹仪（Eyela，日本）；Vortex Genius 3新型旋涡混匀器（IKA，德国）；SPE离子交换柱（60 mg/3 mL）。实验中所用玻璃器皿均在王水（HCl.HNO3， 3∶1， V/V）中浸泡8 h以上，使用前用超纯水冲洗，烘干后使用。

AgNO3（99%）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW=55000）、乙二醇（99%）及AgCl（99%）均购自Aldrich公司；三聚氰胺（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈、浓HNO3、三氯乙酸、乙酸铅（北京化工厂）。所有试剂均为分析纯，所有实验用水均为超纯水。市售某品牌袋装纯牛奶。

2.2 有序纳米银线的制备

通过多元醇法制备纳米银线（AgNWs）[22]。室温下将0.34 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）加到20 mL乙二醇中，升温至170℃，再加入25 mg AgCl粉末形成Ag的结晶核[19，23]。3 min后，在10 min内分5次加入110 mg AgNO3粉末，将此混合体系反应30 min。经6000 r/min离心5 min后，用甲醇清洗得到AgNWs。在合成纳米银线过程中，乙二醇既为溶剂又为还原剂。

采用流体流动法组装有序纳米银线。将0.154 mol/L AgNWs乙醇悬浮液在800 μL/min的流速下流经玻璃毛细管，得到内壁附以有序纳米银线的毛细管拉曼增强基底。

2.3 样品的制备

2.3.1 标准溶液的配制 准确称取0.0100 g三聚氰胺粉末标准品于烧杯中，用甲醇溶解并定容至100 mL， 得到100.00 mg/L三聚氰胺储备液。

2.3.2 牛奶样品的处理 （1）提取 取5 mL牛奶样品，加入15 mL三氯乙酸溶液（ρ=10 g/L），摇匀后再加入1 mL乙酸铅溶液（ρ=22 g/L）（其中三氯乙酸是强酸，铅是重金属，两者均可使蛋白质变性沉淀）。然后超声30 min，10000 r/min离心5 min，提取上清液备用； （2）净化 SPE柱分别经3 mL甲醇、3 mL水活化后，移取10 mL上清液分次上柱，对三聚氰胺进行吸附。然后用3 mL水和3 mL甲醇洗涤SPE柱，洗去杂质，抽干。再用3 mL、5%氨水.甲醇溶液洗脱三聚氰胺，收集洗脱液，抽干。洗脱液于50℃氮吹干后加1 mL水，振荡、溶解、摇匀，待测[24]。