miRNA-93在PCOS大鼠血清中的表达

邢莹莹，李青春，韩艳艳，李小琳

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是生殖功能障碍与糖代谢异常并存的一种特殊疾病。多以高雄激素血症、持续性无排卵或排卵障碍、胰岛素抵抗和高脂血症为主要特点[1]。目前对PCOS的研究多借助于动物实验，PCOS的造模方法有很多，其中脱氢表雄酮(dehydroepi androsterone，DHEA)造模是比较理想的造模方法[2]，从生殖和代谢方面全面评估模型动物的表型特征，为PCOS模型的建立奠定研究基础。

微小RNA(miRNA)是一类约由19～25个核苷酸组成内源性非编码小分子RNA，通过抑制转录后基因表达或促进靶基因mRNAs降解发挥重要的调节作用[3]。每个miRNA都可以调控上百个基因的表达，据推测，人类基因组上约有1/3基因的表达都受到miRNA的调控[4]。近年来，血液中的miRNA又称为循环miRNA，血清中miRNA含量丰富，结构稳定，耐核酸酶并且容易检测到[5-6]，在疾病的早期筛查、区分高危人群等方面具有广阔的应用前景。循环miRNA的含量变化可作为多种疾病的诊断标志物。本文旨在研究miRNA-93及靶基因血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor, VEGFA)在PCOS大鼠模型血清中的表达及相关作用，以期为PCOS的诊断和治疗提供新的靶点，现报道如下。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物选用3周龄雌性SD清洁级大鼠40只，体质量(50±20) g，由河南省动物实验中心提供，生产许可证号：SCXK(豫)2015-0001。大鼠饲养于河南科技大学第一附属医院新区医院实验动物中心，饲养于IVC专用笼，喂食标准饲料，饮用水使用大鼠专用水，笼内垫料每周更换2次，动物实验中心温度维持在(22±1) ℃，湿度为50%左右，明暗交替周期设为12 h。

1.1.2主要试剂及仪器DHEA购于索莱宝公司，注射用大豆油购于RUBIO公司。miRNA提取试剂盒、miRNA Cdna Synthesis Kit、miRNA qPCR Assay Kit，均购于康为世纪生物科技有限公司。50%葡萄糖注射液大鼠胰岛素(insulin,INS)酶联免疫吸附测定试剂盒，武汉优尔生商贸有限公司，大鼠VEGFA酶联免疫吸附实验试剂盒，武汉优尔生商贸有限公司，INS酶联免疫吸附测定试剂盒，武汉优尔生商贸有限公司。荧光定量PCR仪器(美国伯乐公司，Thermo Heraeus Multifuge X1R台式高速冷冻离心机(美国Thermo公司)。罗氏优越型血糖仪(德国ROCHE公司)。

1.2方法

1.2.1构建动物模型将40只雌性SD大鼠随机分为观察组和对照组，每组20只，观察组大鼠每日颈背部皮下注射DHE6 mg·100 g-1体质量+0.2 mL无菌注射用油，对照组每日颈背部皮下注射0.2 mL无菌注射用油剂。均于上午10时，连续皮下注射28 d。

1.2.2标本取材在造模28 d结束后，5%水合氯醛腹腔注射麻醉后摘眼球法，取5～10 mL血，室温放置1 h，以2 000 r·min-1离心10 min，分离血清后进行解剖，取双侧卵巢，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer，PBS)溶液清洗，显微镜下分离卵巢多余的脂肪组织，并称重。固定于中性福尔马林溶液中，进行石蜡包埋切片，用于HE染色。

1.2.3观察内容及方法①每日记录大鼠体质量，解剖后用电子体质量测量仪、电子精密天平及游标卡尺测量子宫、卵巢质量。卵巢质量为左、右卵巢之和。②动情周期：连续2个周期(每个周期4～5 d)进行阴道脱落细胞涂片，采用巴氏染色法观察大鼠动情周期。③酶联免疫吸附实验试剂盒(购于武汉优尔生商贸有限公司)检测大鼠血清INS、VEGFA。④观察两组大鼠双侧卵巢大体解剖，石蜡包埋卵巢组织，进行HE染色，光镜下观察其组织形态。⑤口服胰岛素耐量实验(insulin tolerance test,ITT)：大鼠禁食不禁水12 h，分别以0.5 U·kg-1的剂量腹腔注射50%胰岛素，鼠尾尖取血，用罗氏优越型血糖仪(德国 ROCHE 公司)测定大鼠灌胰岛素后0、15、30、60、120 min的血糖值。⑥口服葡萄糖耐量实验(oral glucose tolerance test,OGTT)：大鼠禁食不禁水12 h，以3 g·kg-1剂量灌服50% 葡萄糖溶液，尾尖取血，用血糖仪测定大鼠灌糖后0、15、30、60、120 min的血糖值。⑦计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)：HOMA-IR=空腹血糖(mmol·L-1)×空腹胰岛素(mIU·L-1)/22.5。⑧血脂测定：应用全自动免疫发光仪(西门子DPC IMMULITE 2000)测定大鼠黄体生成激素(LH)、促卵泡成熟激素(FSH)、睾酮(T)、雌二醇 (E2)及代谢指标血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)。⑨RT-PCR检测大鼠血清miRNA-93表达引物借助https://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站进行设计，委托上海生工有限公司合成。具体步骤按miRNA提取试剂盒、miRNA Cdna Synthesis Kit、实时定量荧光PCR试剂盒检测说明书操作(均购于康为世纪生物科技有限公司)，miRNA-93上游引物：5’-TGCGCCAAAGTGCTGTTCGTGCA-3’，miRNA-93下游引物为试剂盒通用引物，扩增产物为：100bp，内参为U6，上游引物为5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游为5’-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’，扩增产物为：110 bp，采用2-△△Ct法进行分析。

2 结果

2.1大鼠体质量、腹围、卵巢、子宫质量及比较观察组大鼠体质量、子宫质量明显高于对照组，有统计学意义(P<0.05)。大鼠腹围、卵巢模型组略高于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组大鼠体质量，腹围，卵巢、子宫质量及比较

注：①与对照组比较，P<0.01。

2.2大鼠动情周期的变化对大鼠进行2个周期(1个周期4～5 d)的阴道涂片巴氏染色观察动情周期，观察组大鼠动情周期不规律，提示无排卵；对照组动情周期规律(见图1)。动情前期(A)以小、圆、有核上皮细胞为主，持续时间12 h左右。动情期(B)持续时间9～15 h以不规则状无核上皮细胞为主。动情后期(C)有核上皮细胞，无核上皮细胞，白细胞均存在为主，持续时间14～18 h。间情期(D)白细胞为主，持续时间60～70 h。

图1 大鼠动情周期的变化(巴氏染色，×200)

2.3大鼠血清FSH、LH、T、E2水平变化观察组大鼠血清FSH、T、LH水平较对照组明显升高，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，两组LH比较，差异无统计学意义(P>0.05)，E2水平较对照组明显降低，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。

表2 两组大鼠血清 FSH、LH、T水平比较

注：①与对照组比较，P<0.01。FSH:促卵泡成热激素；LH黄体生成激素；T：睾酮；E2:雌二醇。

2.4大鼠血脂变化观察组大鼠血清甘油三酯(TG)水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组与对照组胆固醇(TC)水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表3。

表3 两组大鼠血清TC、TG比较

注：①与对照组比较，P<0.01。TG:甘油三酯；TC:胆固醇。

2.5卵巢形态学变化观察组大鼠卵巢表面苍白，体积增大；镜下见卵泡多呈囊性扩张，变成囊泡即空卵泡，颗粒细胞层数减少多为2～3层、排列疏松，各级卵泡及黄体少见。对照组大鼠卵巢色泽红，表面多个红点或紫点；镜下可见各级发育卵泡及多个黄体，卵泡内颗粒细胞呈多层，多为8～9层，结果见图2。

图2 大鼠卵巢切片(HE染色，×40)

2.6OGTT与ITT结果检测大鼠0、15、30、60、120 min血糖值。结果表明与对照组相比观察组大鼠不能诊断为糖尿病，而胰岛功能受损，结果见图3-4。

2.7两组大鼠空腹血糖、HOMAI-IR比较观察组空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)值明显高于对照组(P<0.01)，观察组大鼠空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)、HOMAI-IR明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，说明大鼠存在胰岛素抵抗，结果见表4。

图3 糖耐量实验

图4 胰岛素耐量实验

组 别nFBG/(mol·L-1)FINS/(mIU·mL-1)HOMAI-IR观察组204.45±0.76①4.14±0.86①0.82±0.41①对照组203.65±0.50 1.34±0.34 0.22±0.05 t3.776.456.35P0.000.000.00

注：①与对照组比较，P<0.01。FBG:空腹血糖；FINS：空腹胰岛素；HOMAI-IR：胰岛素抵抗指数。

2.8ELISA检测血清中VEGFA的表达观察组VEGFA的表达较对照组显著增加，统计分析结果显示：观察组卵巢组织中VEGFA的表达增加(P<0.01)，结果见表5。

表5 两组VEGFA水平比较

注：①与对照组比较，P<0.05。VEGFA:血管内皮生长因子。

2.9大鼠血清miRNA-93的表达量miRNA-93相对基因表达的结果显示：观察组与对照组中相对表达量分别为1.55∶1；SD为0.097、0.032。与对照组比较，miRNA-93在观察组大鼠血清中的表达升高，具有统计学意义(P<0.01,n=6)，结果见图6。

A:观察组；B:对照组。1：mark；4～8：观察组；10～14：对照组。图6 荧光定量PCR检测miRNA-93结果

3 讨论

PCOS是育龄期女性常见的内分泌疾病，患病率为5%～10%，占无排卵性不孕患者的70%～80%[7]。病因至今尚未阐明，研究认为其可能是由于某些遗传基因与环境因素相互作用所致[8-9]。此外，一些细胞因子，如VEGFA也与不孕有关。有研究显示卵巢血管的生成与PCOS的发病机制密切相关[10]。PCOS的诊断标准在国际上一直存在较大的争议，目前比较广泛运用于临床的诊断标准主要有：2003年5月欧洲人类生殖和胚胎学会和美国生殖医学会(ESHRE/ASRM)鹿特丹会议提出的PCOS诊断标准[11]。2010年中华医学会妇产科分会内分泌学组专家学者制定的PCOS诊断标准[12]。现阶段临床医学关于PCOS的诊断方法有基础体温测定、B超、诊断性刮宫、腹腔镜以及内分泌测定等[13]。由于PCOS患者临床取材困难，大鼠具有价格低廉、遗传背景稳定、动情周期规律、便于集中管理监测等优点。采用雄激素诱导动物使其产生伴有胰岛素抵抗的PCOS模型已经成为经典可靠的实验模型[14]。本实验采用脱氢表雄酮造模方法构建PCOS大鼠模型，结果显示模型组中大鼠体质量增加、性周期紊乱、卵巢呈多囊状改变、卵泡成熟障碍，伴有高雄激素血症的同时还出现脂质代谢紊乱、血糖紊乱及胰岛素抵抗、高胰岛素血症。这与人类PCOS有很多相似之处，与国内外一些研究结果是一致的。

循环miRNA是一类在血清、血浆等体液中稳定存在的miRNA分子，具有差异表达明显、检测灵敏、取材方便等特点。大量研究表明循环miRNA在疾病诊断中也具有一定参考价值，可作为一种新型诊断标志物分子。近年来，人们发现在子宫、卵巢、输卵管等女性生殖器官中均有miRNA的表达，并广泛参与调控女性卵泡发育成熟、受精、着床及胚胎发育等生理过程，对维持女性正常生育功能起重要作用[15]。miRNA在PCOS性激素合成分泌、胰岛素抵抗、卵泡发育及成熟、细胞凋亡、炎症等方面均有一定调节作用[16]。PCOS患者脂肪组织中miRNA-93的高表达可导致GLUT4基因的表达下调，miRNA-93的高表达与胰岛素抵抗指数有很大的相关性[19]。研究表明miRNA-93可通过结合靶基因细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制剂1A(CDKN1A)3′-UTR位点在PCOS患者中呈高表达，影响卵泡正常发育及成熟，导致排卵障碍及不孕[18]。PCOS患者血清中miRNAs表达谱存在差异，其异常的miRNAs表达通过影响基因转录后的水平，参与PCOS的发生发展。

VEGFA是一种特异的与血管内皮细胞结合而发挥作用的因子，其功能包括诱导血管生成、增加血管通透性[20]。VEGFA对血管的再生、卵泡血管化、卵泡内的氧化都发挥着重要作用，因此影响卵泡成熟、卵母细胞质量、受孕及胚胎的生长发育[21]。miRNA可以通过调节数个靶基因发挥不同作用，而一个靶基因则可被数个miRNA调控，其相互作用的互联网络十分复杂。Long等证实miRNA-93的靶基因是血管内皮生长因子A(VEGFA)[19]。本实验采用RT-PCR、ELISA分别检测PCOS大鼠血清中miRNA-93及靶基因VEGFA的表达水平，结果显示观察组与对照组相比血清中miRNA-93及靶基因VEGFA表达一致呈高表达，提示VEGFA在卵巢内异常表达、分泌并释放入血，可能是卵巢间质血管化增加的基础，最终导致PCOS患者无优势卵泡发育的原因之一。miRNA-93可通过结合靶基因VEGFA在PCOS患者中呈高表达，影响卵泡正常发育及成熟，导致排卵障碍及不孕。

综上所述，PCOS大鼠模型血清中miRNA-93及靶基因VEGFA表达上调，miRNA-93可能通过转录水平导致VEGFA蛋白增多，从而参与PCOS的发生发展，循环miRNA-93可许可以作为PCOS的一种新型的非侵入性的诊断标志物。然而miRNA在促进颗粒细胞增生、加速颗粒细胞凋亡、阻碍卵泡正常发育及成熟、影响性激素合成及分泌和增强胰岛素抵抗等方面的作用并不完善，仍需进一步深入研究，以揭示miRNA在PCOS中的作用机理，为今后PCOS的诊断和治疗提供新的依据和治疗靶点。

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