移植人羊膜间充质干细胞促进脑出血大鼠神经功能恢复

周洪龙张鸿日闫中杰徐如祥

·基础研究·

移植人羊膜间充质干细胞促进脑出血大鼠神经功能恢复

周洪龙1张鸿日1闫中杰2徐如祥1

目的研究移植人羊膜间充质干细胞（hAMSCs）是否能促进脑出血大鼠神经功能恢复，探索其可能作用机制。方法138只雄性Wistar大鼠按照随机数字表法分为人皮肤成纤维细胞（Fibroblasts）治疗组（46只）、磷酸盐缓冲液（PBS）治疗组（46只）和hAMSCs治疗组（46只）。脑出血模型采用颅内注射Ⅶ型胶原酶制作，24 h后颅内移植hAMSCs、Fibroblasts和PBS。应用流式细胞仪检测hAMSCs表面抗原。免疫荧光检测细胞分化、血管再生和神经再生。酶联免疫吸附剂测定试剂盒检测脑源性神经营养因子（BDNF）和血管内皮生长因子（VEGF），改良神经功能评分（mNSS）检测行为学。结果分离培养的hAMSCs呈现成纤维细胞样细胞形态，表达CD29、CD44、CD90、CD105和CD166，不表达CD19、CD34和CD45。mNSS评分显示，颅内出血（ICH）7 d后，hAMSCs组评分明显高于Fibroblasts治疗组和PBS治疗组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。ICH后14 d，hAMSCs组BrdU+细胞数目（55.33±6.59）高于Fibroblasts组（26.66±3.58）和PBS组（25.50±2.90），差异具有统计学意义（P＜0.05）。hAMSCs组Brdu+/DCX+细胞数目（30.66±3.65）高于Fibroblasts组（11.83±2.70）和PBS组（10.00±2.54），差异具有统计学意义（P＜0.05）。hAMSCs组血管性血友病因子+血管数目[（67.50±6.76）/mm2]高于Fibroblasts组[（31.66±6.33）/mm2]和PBS组[（28.83±5.58）/mm2]，差异具有统计学意义 （P＜0.05）。ICH后7 d和14 d，hAMSCs组BDNF表达水平 [（63.16±2.31）pg/mg，（38.57±3.69）pg/mg]高于Fibroblasts组[（46.18±2.45）pg/mg，（20.52±2.81）pg/mg]和PBS组[（43.18±2.30）pg/mg，（18.28±2.39）pg/mg]，差异具有统计学意义（P＜0.05）。ICH后7、14、21 d，hAMSCs组VEGF表达水平 [（43.32±3.65）pg/mg，（30.90±2.62）pg/mg，（24.89±2.85）pg/mg]高于Fibroblasts组[（22.88±2.62）pg/mg，（15.41±2.40）pg/mg，（10.57±1.54）pg/mg]和PBS组 [（20.81±3.06）pg/mg，（14.44±2.32）pg/mg，（11.42±1.48）pg/mg]，差异具有统计学意义（P＜0.05）。移植的hAMSCs在颅内存活最少27 d，不表达神经元标志物β-tubulinⅢ和星型胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白。结论移植hAMSCs能促进脑出血大鼠神经功能恢复，其作用机制可能是通过增加神经营养因子表达，促进血管再生和神经再生。因此hAMSCs是治疗脑出血的理想干细胞。

间充质干细胞；羊膜；脑出血；移植；神经功能恢复

脑出血由颅内血管破裂引发，其约占卒中的10%～15%，常导致成人高的致死率和致残率，是一种严重的神经系统疾病[1]，目前尚少见有效的药物治疗，手术治疗仍具有不确定性和争议性[2]。因此，发展替代的治疗方法，如细胞治疗是非常重要和必要的。

间充质干细胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）是一种具有自我更新和多向分化能力的非造血干细胞[3]。来自骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是第一种被报道的和被广泛研究的间充质干细胞。最近，有研究报道移植BMSCs能促进脑出血动物神经功能恢复[4]。然而，BMSCs的来源有限，获取骨髓过程具有侵袭性，另外随着供者年龄的增长，BMSCs的数目、分化能力和频率下降[5]。因此，有必要探索其他的MSCs来源。在最近几年，来源于人胎盘羊膜组织的间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）被认为是一种可替代的MSCs来源。与BMSCs相似，在特定的条件下，这些细胞能向包括神经系列细胞在内的多种系列细胞分化[6,7]。另外与BMSCs相比，hAMSCs具有来源丰富、获取无创和更强的分泌和免疫调节能力等诸多优点。最近，报道hAMSCs具有长效的免疫调节和提高阿尔茨海默病小鼠认知功能[8]。另外，移植hAMSCs能减轻卒中大鼠行为神经功能障碍[9]。目前尚少有研究调查hAMSCs对脑出血的治疗效应。因此本研究致力于调查是否颅内移植hAMSCs能促进脑出血大鼠的功能恢复并探索其可能的作用机制。

材料与方法

一、分离hAMSCs和细胞培养

胎盘取自6位剖宫产健康孕妇，并与她们签订知情同意书。后续处理过程经陆军总医院伦理委员会知情同意。参照改进的文献报道分离hAMSCs方法，简述如下：把羊膜从绒毛膜上钝性分离下来后，用含有1%青霉素/链霉素的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）反复冲洗去除血液和污物后，用0.25%胰蛋白酶消化30 min后，在显微镜下用细胞刮轻轻刮去羊膜上皮层，剩下的组织用眼科剪剪成碎片后用1%Ⅱ型胶原酶37℃消化60 min。获取的细胞培养在添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中。人皮肤成纤维细胞（Fibroblasts）购自中国医学科学院。

二、流式细胞分析

第5代hAMSCs与CD34、CD105、CD19、CD29、CD44、CD45、CD90和CD166抗体反应。所有的抗体购自BD公司，细胞荧光通过流式细胞仪检测。

三、动物和实验分组

138只雄性Wistar大鼠[体质量（240～260）g]购自北京维通利华公司。大鼠分为Fibroblasts治疗组（46只），PBS治疗组（46只）和hAMSCs治疗组（46只）。

四、建立大鼠脑出血模型

所有的手术过程遵循相关动物管理条例，脑出血模型通过颅内立体定向注射Ⅶ胶原酶制作。大鼠麻醉后固定在立体定向仪框架上，用颅钻钻孔，1 μl无菌PBS包含0.5 U胶原酶用微量泵缓慢注入颅内（前囟后0.2 mm，硬膜下6.0 mm，中线旁开3.0 mm）。钻孔用骨蜡封闭，缝合皮肤切口。

五、细胞移植

颅内出血 （intracerebral hemorrhage，ICH）1 d后，包含5×105个hAMSCs或Fibroblasts的10 μl PBS分别移植到hAMSCs组或Fibroblasts组大鼠脑出血旁区域（前囟后0.2 mm，硬膜下3.5 mm，中线旁开3.0 mm），等量不含细胞的PBS注射在PBS组大鼠。为了标记增殖的细胞，所有的大鼠从ICH 1 d后开始每天腹腔注射BrdU（50 mg/kg）并持续13 d。

六、神经功能评估

用改良神经功能评分 （modified neurological severity score，mNSS）评估大鼠神经功能，由2名不了解实验分组的研究员分别在1、7、14、21和28 d时进行测试。

七、免疫荧光染色和组织病理学

在脑出血3 d或14 d，大鼠经灌注固定后，取出脑组织，然后固定，脱水后切成片厚10 μm的冠状脑片。对于免疫荧光染色，切片加一抗为：大鼠anti-BrdU，兔anti-DCX，兔血管假性血友病因子/血管性血友病因子抗体 （anti-von willebrand factor，antivWF），兔胶质纤维酸性蛋白抗体和兔抗βIII微管蛋白（Tuj1）。一抗4℃孵育过夜后，用PBS冲洗后，加相应的荧光二抗室温孵育2 h。对于BrdU和DCX双标染色，切片预先在37℃的2 N盐酸溶液中孵育30 min。图片用共聚焦荧光显微镜拍摄，用Image J软件进行分析。

八、ELISA分析

为了测量因子表达水平，在脑出血后7、14、21和28 d，提取损伤侧大脑半球在PBS中匀浆，4℃离心1 000 r/min，上清液用酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（R&D Systems）检测脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量。

九、统计学分析

统计学分析由SPSS13.0完成。实验结果用均数±标准差（±s）表示。行为学数据和因子水平定量分析用重复测量的ANOVA，其它数据用单向ANOVA进行分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结果

一、hAMSCs的特性

P5代hAMSCs生长良好并呈成纤维样细胞形态 （图1）。流式细胞仪分析显示hAMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD105和CD166，不表达CD1、CD34和CD45（图2）。

图1 P5代人胎盘羊膜组织间充质干细胞呈现典型的成纤维样细胞形态

二、hAMSCs治疗增加内源性神经再生

在 ICH后 14 d，hAMSCs组 Brdu+细胞数目（55.33±6.59）高于Fibroblasts组（26.66±3.58）和PBS组（25.50±2.90），差异具有统计学意义（P＜0.05）。双标染色Brdu和DCX结果显示，hAMSCs组Brdu+/ DCX+细胞数目 （30.66±3.65）高于 Fibroblasts组（11.83±2.70）和PBS组（10.00±2.54），差异具有统计学意义（P＜0.05），BrdU+细胞和BrdU+/DCX+细胞数目在Fibroblasts组和PBS组差异无统计学意义 （P＞0.05）（图3A、3B）。这些结果表明hAMSCs治疗能增加脑室下区（subventricular zone，SVZ）神经干细胞增殖和分化。

图2 人胎盘羊膜组织间充质干细胞的流式细胞仪鉴定

三、hAMSCs治疗促进血管再生

为了调查是否hAMSCs治疗能促进血管再生，脑切片用染色并定量分析脑出血灶旁血管密度 （图3C），结果显示在ICH后14 d，hAMSCs组vWF+血管数目（67.50±6.76）/mm2高于Fibroblasts组（31.66±6.33）/mm2和PBS组（28.83±5.58）/mm2，差异具有统计学意义（P＜0.05），在 Fibroblasts组和 PBS组 vWF+血管数目比较差异无统计学意义（P＞0.05）（图3D）。

四、hAMSCs体内存活与分化

移植的hAMSCs在体内最少存活27 d，大部分细胞分布在出血灶旁区域。相反在Fibroblasts组，移植的Fibroblasts并不能检测到，提示移植的Fibroblasts在27 d内被从宿主脑内剔除。在ICH后28 d，双标染色结果显示移植的hAMSCs并不能向神经元和星型胶质细胞分化（图4A）。

五、hAMSCs治疗增加BDNF和VEGF表达水平

用ELISA试剂盒检测ICH后7、14、21和28 d大鼠BDNF和VEGF表达水平，结果显示在ICH后7 d和14 d，hAMSCs组BDNF表达水平 [（63.16±2.31)pg/mg，（38.57±3.69)pg/mg]高于Fibroblasts组[（46.18±2.45)pg/mg，（20.52±2.81)pg/mg]和PBS组[（43.18±2.30)pg/mg，（18.28±2.39)pg/mg]，差异具有统计学意义（P＜0.05)（图4B)。在ICH后7、14和21 d，hAMSCs组VEGF表达水平 [（43.32±3.65)pg/mg，（30.90±2.62)pg/mg，（24.89±2.85)pg/mg]高于Fibroblasts组[（22.88±2.62)pg/mg，（15.41±2.40)pg/mg，（10.57±1.54)pg/mg]和PBS组[（20.81±3.06)pg/mg，（14.44±2.32)pg/mg，（11.42±1.48)pg/mg]，差异具有统计学意义（P＜0.05)（图4C)。在任何时间点Fibroblasts和PBS组BDNF和VEGF水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05)。

六、hAMSCs治疗促进运动功能恢复

为了评估hAMSCs治疗是否能促进脑出血大鼠运动功能恢复，用mNSS评估大鼠在ICH后1、7、14、21和28 d运动神经功能。结果显示在治疗前，hAMSCs组、Fibroblasts组和PBS组mNSS评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05)，然而，从ICH后7 d开始持续到28 d，与Fibroblasts组和PBS组相比，hAMSCs组 mNSS评分更高。在任何时间点Fibroblasts组和PBS组mNSS评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05)（图4D)。

图3 人胎盘羊膜组织的间充质干细胞促进神经再生和血管再生

讨论

目前的研究结果显示hAMSCs治疗能够增加损伤脑营养因子BDNF和VEGF的表达水平，增加SVZ神经干细胞增殖和分化，促进出血灶旁血管再生，最终促进脑出血大鼠神经功能恢复。

图4 人胎盘羊膜组织的间充质干细胞体内分化及提高运动功能

体内研究结果显示移植的hAMSCs在损伤脑内存活至少27 d，然而移植的Fibroblasts在这个时间点并不能检测到，表明hAMSCs在体内具有良好的免疫耐受性。尽管一些研究组报道MSCs在体内能向神经细胞分化，但是这些细胞是否能真正分化为神经系列细胞，目前还存在广泛争议[10-11]。在体内，笔者并没有找到hAMSCs向神经元或胶质细胞分化的证据，这些发现结合移植的hAMSCs促进脑出血大鼠早期功能恢复，说明hAMSCs起作用并不是通过细胞替代而是通过其它的途径。

神经再生和血管再生可能是hAMSCs治疗起作用的重要机制。各种损伤包括脑出血能诱导神经再生，其能促进损伤修复和促进神经功能恢复[12]。因此，增强神经再生是ICH治疗的一个重要目标，在目前的研究中发现与Fibroblasts组和PBS组相比，hAMSCs治疗增加SVZ的BrdU+细胞和BrdU+/DCX+细胞数目，表明hAMSCs能促进神经再生。hAMSCs治疗促进神经再生的原因可能是通过分泌营养因子，众所周知MSCs在体内体外能产生和分泌神经营养因子。BDNF和促血管再生因子VEGF是两个重要的营养因子能促进神经再生[13-14]。在本研究中发现与Fibroblasts组和PBS组相比，hAMSCs治疗增加受损脑BDNF和VEGF的表达水平。通过增加BDNF和VEGF表达，hAMSCs因此促进神经再生。另外本研究也发现与Fibroblasts组和PBS组相比，hAMSCs治疗增加脑出血灶旁vWF+血管数目。该结果并不奇怪，有文献报道hAMSCs具有强大的促血管再生能力，能分泌包括VEGF在内的多种促血管生成因子。移植hAMSCs能促进多种疾病血管再生，比如后肢缺血[15]。

总之，本研究结果表明hAMSCs治疗能促进脑出血大鼠神经功能恢复，其可能是通过增加营养因子的表达，增强内源性神经再生和血管再生起作用。该结果也为未来临床应用hAMSCs治疗ICH提供了理论基础。

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Transplantation of human amniotic mesenchymal stem cells promotes neurological recovery in an intracerebral hemorrhage rat model

Zhou Honglong1,Zhang Hongri1,Yan Zhongjie2,Xu Ruxiang1.1Affiliated Bayi Brain Hospital,The PLA Army General Hospital,Beijing 100700,China;2Department of Neurosurgery,The Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China

ObjectiveWe assessed whether transplantation of human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSCs)promotes neurological recovery in an intracerebral hemorrhage rat model.In addition,the potential mechanisms underlying the possible benefits of this therapy were investigated.MethodsA total of 138 male Wistar rats were divided into fibroblasts group,phosphate-buffered saline (PBS)group and hAMSCs group(n=46).The intracerebral hemorrhage (ICH)models were induced by intrastriatal injection of VII collagenase and then intracerebrally administered hAMSCs,Fibroblasts,orPBS at 24 h after ICH.hAMSCs were characterized using flow cytometry.Immunohistochemistry were performed to assay differentiation,angiogenesis and neurogenesis.The expressions of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)and vascular endothelial growth factor(VEGF)were analyzed by ELISA. Neurological function was assessed with the modified neurological severity score (mNSS).ResultshAMSCs displayed a fibroblast-like morphology,were positive for CD29,CD44,CD90,CD105,and CD166,and negative for CD19,CD34,and CD45.From 7 d after ICH,mNSS scores of the hAMSCs group were significantly higher than that of PBS group and Fibroblasts group(P＜0.05).Fourteen days after ICH,the number of Brdu+cells in the hAMSCs group (55.33±6.59)was significantly higher than that in PBS group(25.50±2.90)and Fibroblasts group(26.66±3.58)(P＜0.05).The number of Brdu+/DCX+cells(30.66±3.65)in the hAMSCs group was significantly higher than that in PBS group (10.00±2.54) and fibroblasts group(11.83±2.70)(P＜0.05).The number of von Willebrand factor(vWF+)blood vessels [(67.50±6.76)/mm2]in the hAMSCs group was significantly higher than that in PBS group [(28.83±5.58)/ mm2]and Fibroblasts group [(31.66±6.33)/mm2](P＜0.05).Seven and fourteen days after ICH,the levels of BDNF[(63.16±2.31)pg/mg,(38.57±3.69)pg/mg]of the hAMSCs group were significantly higher than that of PBS group[(43.18±2.30)pg/mg,(18.28±2.39)pg/mg]and Fibroblasts group[(46.18±2.45)pg/mg, (20.52±2.81)pg/mg](P＜0.05).Seven,fourteen and twenty-one days after ICH,the levels of VEGF [(43.32±3.65)pg/mg,(30.90±2.62)pg/mg,(24.89±2.85)pg/mg]of the hAMSCs group were significantly higher than that of PBS group [(20.81±3.06)pg/mg,(14.44±2.32)pg/mg,(11.42±1.48)pg/mg]and Fibroblasts group [(22.88±2.62)pg/mg,(15.41±2.40)pg/mg,(10.57±1.54)pg/mg].The transplanted hAMSCs survived for at least 27 d and were negative for fi-tubulinⅢand glial fibrillary acidic protein.ConclusionhAMSCs treatment significantly promotes neurological recovery in rats after ICH.The mechanism of action could be mediated by increasing neurotrophic factor expression,and promotion of neurogenesis and angiogenesis.Thus,hAMSCs are candidate stem cells for the treatment of ICH.

Mesenchymalstem cells; Human amniotic; Intracerebralhemorrhage; Transplantation;Neurological recovery

2016-11-14）

（本文编辑：张丽）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.01.009

全军医药科技“十二五”重点项目（BWS11J002；BWS12J010）；国家自然科学基金（81401032）

100700 北京，陆军总医院附属八一脑科医院1；050000 石家庄，河北医科大学第二医院神经外科2

徐如祥，Email：jzxuruxiang@163.com

周洪龙,张鸿日,闫中杰,等.移植人羊膜间充质干细胞促进脑出血大鼠神经功能恢复[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志, 2017,3(1):033-039.