马齿苋黄酮提取工艺及其分离纯化和抑菌作用分析

●郑楚萍陈法江陶涛

马齿苋黄酮提取工艺及其分离纯化和抑菌作用分析

●郑楚萍1陈法江2陶涛3

目的：探究马齿苋黄酮提取工艺的条件及对其抑菌作用的研究。方法：马齿苋黄酮提取的过程大致为：首先采用超声波法粗提马齿苋黄酮液，再采用正交试验对粗提液进行优化，最后经大孔吸附树脂对优化液进行纯化，再通过纸片扩散法对纯化后的黄酮进行抑菌试验。结果：我们研究得出在料液比为1:25、温度50℃、时间40m in、功率200W是马齿苋黄酮最佳的提取条件，在此条件下，黄酮的得率为3.6%。抑制强弱顺序为：酵母菌＞黑曲霉＞醋酸菌＞大肠杆菌。

马齿苋；黄酮；提取与纯化；抑菌活性

马齿苋使用常见的中草药，也是大众喜欢的野生蔬菜，随着对马齿苋的不断深入了解，马齿苋已经公认的为“药食同源”的植物，所以无论从保健上还是从食用上来看，马齿苋都是一种不可多得的药品及食物。根据有关文献表明马齿苋对痢疾杆菌具有杀菌作用，其煎服对大肠杆菌也有一定的疗效，其提取液对某些真菌也具有一定的抑制效果，而本文的主要分析是对其提取、纯化马齿苋黄酮的工艺条件并对其抑菌作用进行初步研究。现报道如下。

1 材料和方法

1.1 马齿苋

在广州某药店购买；大孔吸附树脂：由东鸿化工有限公司提供；其他试剂均由广州医科大学农产品加工及贮藏实验室提供。

1.2 马齿苋中黄酮的提取和测定

取适量马齿苋物品，放于圆底烧瓶中，并去除其中夹杂的脂肪杂质，然后将抽提液冷却过滤，将上层液体弃去，放置于低温干燥箱中烘干，备用。黄酮的含量通过比色法测定[1]，溶液的吸光值用分光光度计在510nm处测定。

1.3 马齿苋黄酮提取单因素试验和正交试验

对乙醇体积分数、料液比、温度、时间和超声功率进行单因素试验。在单因素试验的基础上，确定正交试验的工艺参数，选择四因素三水平进行正交试验，经方差分析确定马齿苋黄酮提取的最佳工艺条件。

1.4 马齿苋中提取液的纯化

将浓度为0.5g/m L的黄酮提取液上层放在预先处理好的大孔树脂(pH为中性)层析柱中，控制流速为0.5m L/m in，达到饱和后用70%的乙醇作为洗脱剂以2m L/min的流速进行洗脱，自动收集器收集洗脱液。

1.5 黄酮的抑菌活性

黄酮的抑菌活性的测定采用纸片扩散分析方法。大肠杆菌、醋酸菌、酵母菌和黑曲霉用作指示细菌并接种于平板上。无菌滤纸片于黄酮溶液(5mg/m L)中浸湿，取出，置于平板上。以生理盐水作为对照。培养箱培养后，对抑菌区进行观察测定。

1.6 统计学分析

采用SPSS21.0对试验数据进行单因素方差分析，其中计数资料采用卡方验，计量资料采用t检验，当P＜0.05为差异显著有统计学意义。

2 结果

2.1 超声波辅助法马齿苋黄酮的单因素分析

（1）乙醇浓度对马齿苋提取的影响：在本次研究中采用的为70%的无水乙醇为溶剂，在温度、时间等条件不变情况在分别采用不同浓度的乙醇后，发现随着浓度的增加马齿苋提取效果呈现一个先上升后下降的趋势，提取效果在乙醇浓度为70%附近效果最好。（2）温度对马齿苋提取的影响：当固定其他条件，而温度作为变量时发现，在不同的温度下，开始随着的温度的升高马齿苋的提取液效果也升高，在大约60℃左右时随着温度的升高，提取浓度将不再变化。（3）提取时间对马齿苋提取效果的影响：固定其他条件，将提取时间作为变量时发现，同乙醇浓度对马齿苋的影响相同，随着时间的变化，呈单峰形式，在大约40m in左右时达到峰值。（4）料液比对马齿苋黄酮提取的影响：料液比对马齿苋提取的影响与温度的影响大致相同，在1:25处提取达到最佳状态。（5）功率的影响：固定其他条件，而功率作为变量时，功率对马齿苋黄酮提取的影响也是一个单峰改变，并且在200W处为最佳提取功率。

2.2 正交实验

选取料液比、温度、时间、功率进行四因素三水平的正交试验，确定最佳条件，最终发现四个因素中对马齿苋黄酮体影响最大的因素就是功率，并且在料液比1:25，温度50℃、40m in、200W处提取的效果最佳。

2.3 提纯

提取的粗黄酮经干燥后，使用大孔吸附树脂进一步纯化，得出采用70%的无水乙醇将黄酮洗出来后在采用蒸馏水洗，洗出来的曲线呈单一峰。

2.4 抑菌结果的对比

马齿苋分别对酵母菌、黑曲霉、醋酸菌、大肠杆菌进行体外实验，发现马齿苋对酵母菌抑菌较大、其次为黑曲霉、最后为大肠杆菌。

3 讨论

大量研究表明，马齿苋具有各种生物学效应，主要包括骨骼肌松弛作用，镇痛和抗炎性作用，抗真菌活性和抗生育作用。黄酮是一大类化合物的总称，经过研究其具有丰富的生物和药理活性，如能够抗细菌、抗真菌、抗螨虫、抗高血压活性、消炎和抗病毒，随着对黄酮结构深入的研究，这类天然产物正逐渐地成为抗菌研究的主题。马齿苋黄酮研究的热点引起了化学家和免疫生物学家的重视，尤其是对免疫调节和抗病毒特性。同时，它们的抗菌活性也值得进一步研究。

在本次研究中发现对马齿苋黄酮提取最有利的条件为1:25、温度50℃、时间40min、功率200W是马齿苋黄酮最佳的提取条件。在此条件下，黄酮的得率为3.61%，在孙希云[2]的报道中采用无水乙醇对马齿苋进行分离纯化，最终得到的浓度为3.52%，这与本文的结论大致相同，但是张特立[3]采用与孙希云相同的条件、过程提取的黄酮仅为0.63%，这种显著性差异是可能是由于马齿苋的不通过引起的。在本次研究中的抑菌强弱顺序为：酵母菌＞黑曲霉＞醋酸菌＞大肠杆菌。结果对马齿苋黄酮的综合利用和抑菌机制的研究都具有重要意义。基于这些结果，可以看出马齿苋黄酮在食物腐败、食物中毒的预防和治疗方面能够发挥显著的作用。

（作者单位：1广州医科大学药学院；2广州医科大学研究生院；3广州医科大学公共卫生学院）

[1]王英豪,魏国强,张理平.马齿苋黄酮含量测定方法的建立[J].福建中医药大学学报,2012,22(2):44-46.

[2]孙希云,牛广财,孟宪军,等.马齿苋中黄酮类化合物的最佳提取工艺.食品与发酵工业,2004,30(11):135-137.

[3]张特立,于春月.马齿苋中总黄酮的提取工艺研究.黑龙家医药科学,2013,36(4):37-38.

郑楚萍（1990～），女，硕士研究生，实验师，研究方向为药物化学研究。