猪流行性腹泻疫苗研究和开发进展

李春华,王荣谈,何锡忠,丁卫星,蒋凤英,倪建平,3,赵本进,3∗

(1上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106;2上海瑞丰农业科技有限公司,上海201106;3上海佳牧生物制品有限公司,上海201106)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的高度接触性肠道传染病,PEDV可感染各种年龄的猪,引起水样腹泻、呕吐和脱水等临床症状,哺乳仔猪感染更为严重,病死率达80%—100%[1]。该病最早报道于1971年在英格兰的猪场中暴发,1978年在比利时首先报道分离到PEDV[2],此后,猪流性腹泻疫情在世界各地养猪业中均有暴发流行。国内最早报道于20世纪70年代,在1984年确定病原为PEDV。从1984年到2010年初,国内猪场中存在PEDV的感染,但并没有呈现大规模的暴发。从2010年末开始,哺乳仔猪流行性腹泻在全国出现较大范围的流行,尤其在华东和华南大部分地区的猪场集中暴发,发病日龄小、涉及面广,死亡率高,给养猪业带来巨大经济损失[3-4]。2013年5月PED首次在美国暴发,疫情蔓延迅速,短短数月已传播至30多个州的4 000多个养猪场,引起700多万头仔猪死亡;之后,PED传播到北美洲的加拿大、墨西哥等国,出现暴发流行[5-7],从而改变了PED长期以来只出现在亚洲和欧洲国家的历史,引起了国际社会和科学界的极大关注。

PEDV属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属,病毒粒子呈球形,有囊膜,直径约95—190 nm。PEDV的基因组为单股正链RNA,不同毒株基因组大小不等,全长约为28 kb,包含5’cap结构和3’polyA尾。PEDV全基因组由5’端非编码区、3’端非编码区和至少7个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)组成,编码3个非结构蛋白(复制酶1a、1b及非结构蛋白ORF3)和4个结构蛋白(纤突蛋白S,囊膜蛋白E,膜蛋白M,核衣壳蛋白N),它们在基因组的顺序为5’UTR-P1a∕1b-S-ORF3-E-M-N-3’UTR。PEDV S基因编码纤突蛋白(S蛋白),是病毒重要的I型跨膜蛋白,也是PEDV主要的免疫原性蛋白,在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞,诱导机体产生中和抗体,因此很多研究将S蛋白被作为疫苗研究的目的蛋白。

与多数病毒病一样,对PED的防制尚无特效的药物,主要依赖疫苗预防接种。几十年来,国内外猪病研究者研究出了PED灭活疫苗、活疫苗、基因工程疫苗等,有的已经商品化生产应用,有的尚处于研发阶段,本文就此做一综述。

1 灭活疫苗

PED灭活疫苗经历了组织灭活苗和细胞灭活苗两个阶段。在早期的欧洲,曾将发病猪场死亡仔猪的肠道内容物处理后返饲怀孕母猪,诱导母猪产生免疫抗体,从而保护仔猪,控制PED的流行。但该方法不适用于非发病猪场,而且难以控制病毒含量,并容易感染其他病毒,已被禁止使用。

国内最早的PED疫苗也是组织灭活苗,1993年,哈尔滨兽医研究所王明等[8]将PEDV沪毒株接种仔猪,取发病仔猪的肠内容物和小肠黏膜灭活后加佐剂制备成国内首个PED组织灭活苗。1994—1995年,马思奇等[9]采用添加胰酶的方法,将CV777适应VERO细胞连续传代,用第28代细胞毒制备出氢氧化铝灭活疫苗;之后又用低代次PEDV CV777细胞毒与猪传染性胃肠炎(TGEV)华毒株制备了TGE-PED二联灭活疫苗,为国内猪场长期使用的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(华毒株+CV777株)。1999年,上海市农业科学院的钱永清等[10]从上海郊区的发病猪场分离到一株PEDV,命名为S毒株,并能在VERO细胞上传代,出现病变;邹勇等[11]采用该毒株制备了PED-TGEV-PoRV(猪轮状病毒)三联灭活疫苗,接种肉猪和妊娠母猪后15 d产生较高的抗体水平,免疫有效期6个月以上,临床试验显示仔猪通过被动免疫获得保护,保护率达93%,母猪保护率为98%。美国爆发PED之后,Zoetis公司制备的PED全病毒灭活疫苗于2014年9月获得美国农业部的条件性许可,以2头份剂量免疫分娩前的母猪,从而使仔猪获得被动免疫[12]。

灭活疫苗安全、稳定,免疫效果不受母源抗体的影响,通过免疫妊娠母猪使其所产仔猪获得被动免疫保护。但是,灭活疫苗也存在缺点,接种剂量大,一次免疫无法产生足够高的抗体水平,通常需要加强免疫;而且经后海穴注射接种PED灭活苗,需要2周时间才能产生完全免疫力,不适合紧急预防接种[13]。另外,灭活疫苗只能通过注射免疫,诱导产生的主要是循环抗体IgG,可抵御全身感染,而不能有效诱导黏膜免疫,仔猪无法获得分泌性抗体SIgA,因而不能全面保护猪肠道黏膜感染。

2 活疫苗

1998—1999年,佟有恩等[14]成功培育了PEDV CV777克隆弱毒株,制备出PED弱毒活疫苗;并将TGE及PED克隆弱毒株以1∶1配比制成TGE-PED二联弱毒疫苗,毒价为107.0—7.5TCID50∕0.3 mL,主动免疫和被动免疫的保护率分别为97.7%和98%,猪场田间试验达到95%以上的保护率,可用于紧急预防接种。2000年,李树根等[15]应用制备的PED-TGE二联弱毒疫苗(PEDV-G1P83株+TGEV-AG1株)进行区域试验,免疫后可使初生仔猪、断奶仔猪和肥育猪抵抗TGEV和PEDV强毒的攻击,明显降低发病率和死亡率。2002年,周仲芳等[16]验证了该二联弱毒疫苗在诱导抗体产生方面无干扰,与两个疫苗单独免疫产生的抗体变化趋势相似,在7日龄时仔猪获得较高的被动免疫抗体效价。

国外对PED活疫苗的研究早期集中在亚洲国家。1997年,应用在Vero细胞上传代适应的100代毒PEDV 83P-5株制备的弱毒疫苗在日本获得许可,应用于母猪[17]。1999年,韩国Kweon等[18]将分离的KPEDV-9野毒株在适应VERO细胞,用93代毒接种妊娠母猪,可使其免疫力增强,新生仔猪可以抵抗PEDV野毒的感染;免疫母猪的安全性试验显示分娩母猪产仔数达到平均水平,此弱毒株可以作为疫苗株用于保护哺乳仔猪免受PEDV的感染。2007年,韩国的Song等[19]将PEDV在VERO细胞上适应传代,获得了DR13弱毒株,采取口服和肌肉注射途径免疫妊娠后期的母猪,用PEDV强毒攻击检测疫苗保护性。结果显示,口服免疫组的强毒攻击致死率为13%,明显低于肌肉注射组(60%),而且口服免疫组母猪所产仔猪的抗PEDV IgA浓度较高;此DR13弱毒株经过3次动物回归试验,仍然安全,可以作为口服疫苗株,诱导妊娠后期的母猪获得高水平的免疫反应,抵抗PEDV的感染,该疫苗已经在韩国、菲律宾获得许可和应用。针对2014—2015年韩国出现的PEDV疫情,应用 G2a型新 PEDV毒株制备的疫苗即将获得许可[20]。

弱毒疫苗无需佐剂,单次免疫即可获得持久的免疫力,还可诱导较强的细胞免疫反应,保护效果好。但其存在散毒和返强的风险,安全性有时难以确保,有的免疫功能低下者接种后可能导致发病。

3 基因工程疫苗

随着生物技术的发展,利用基因工程方法研究的猪流行性腹泻疫苗有以下几种:转基因植物疫苗、乳酸杆菌口服疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗等。

3.1 转基因植物疫苗

2003年,韩国Bae等[21]将PEDV中和表位区域COE基因转入烟草中,构建了表达PEDV抗原的转基因烟草,利用表达的抗原口服免疫小鼠,尽管PEDV抗原的表达水平不高,但仍能诱导小鼠产生体液免疫和黏膜免疫应答,保护宿主细胞免受PEDV感染。2005年,Kang等[22]将PEDV中和表位基因在无尼古丁的烟草中表达,可将外源病毒抗原的表达量提高到占全部可溶性植物蛋白的2.1%。目前,用在无烟碱烟草中成功表达的含中和表位的PEDV S蛋白免疫接种仔猪,显示出良好的保护作用[23]。但是,由于烟草中大量的生物碱对人畜有害,大规模的提取和纯化方法,较低表达量的外源抗原在口服时会被消化,合适的饲喂量、抗原的稳定性及有效剂量尚需深入研究,所以转基因植物疫苗离临床应用还有很多需要解决的问题。

3.2 乳酸杆菌口服疫苗

微生态制剂可以调节肠道菌群,维持机体健康,乳酸杆菌是制备微生态制剂常用的益生菌。近年来,将病原微生物的抗原基因应用乳酸杆菌系统进行表达,制备口服微生态制剂疫苗也多有研究。口服疫苗可以刺激黏膜免疫,产生IgA抗体,抵抗病原入侵,有效预防病毒性腹泻,所以PEDV的乳酸杆菌口服疫苗研究较多。

2007年,Hou等[24]报道用乳酸菌表达的PEDV N蛋白能够刺激机体产生针对PEDV N蛋白的黏膜抗体IgA和循环抗体IgG。2008年,董丽娜等[25]扩增出501 bp的PEDV COE基因片段,成功构建了PEDV部分S蛋白乳酸乳球菌表达载体系统,经乳链菌肽(Nisin)诱导后在菌体细胞表面成功表达了具有反应原性的PEDV部分S蛋白。2009年,胡桂学等[26]将董丽娜构建的含有PEDV S蛋白COE的重组菌大量培养,诱导表达后进行动物实验,分别口服免疫妊娠母猪和断奶仔猪,检测结果显示,与对照组相比,免疫妊娠母猪乳汁中sIgA显著升高;免疫仔猪血清中IgG和sIgA明显增加,淋巴细胞增殖试验刺激指数差异显著。

2009—2010年,葛俊伟等[27-29]报道用干酪乳杆菌表达系统分别表达了PEDV N蛋白、S1蛋白和中和抗原位点(COE),用重组干酪乳杆菌分别口服免疫小鼠,测定了免疫后不同时间血清中特异性IgG、粪便中特异性的sIgA水平以及血清的中和活性,并测定免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和细胞因子水平。结果显示免疫组小鼠血清、粪便中检测到较高水平的特异性IgG、sIgA(P＜0.01),脾淋巴细胞增殖指数明显高于对照组,IL-4和IFN-γ水平显著提高(P＜0.01),含有pPG-1-COE的重组干酪乳杆菌诱导的血清具有中和活性(1∶12),该重组干酪乳杆菌表达系统可诱导小鼠产生对猪流行性腹泻病毒特异的黏膜免疫应答和系统免疫应答。2012年,Liu等[30]构建了分别表达PEDV N蛋白和S1蛋白的重组乳酸菌,通过口服免疫,证明乳酸菌表达的PEDV S1蛋白和N蛋白的联合应用可以诱导高水平的黏膜免疫和全身免疫反应。

3.3 核酸疫苗

核酸疫苗是将外源抗原基因直接导入机体细胞内,利用宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生特异性免疫应答,又称为基因疫苗或DNA疫苗,具有免疫保护力更强、更持久的优点,但多数疫苗仍处于试验研究阶段。

2013年,Meng等[31]应用真核表达载体构建了表达PEDV S基因的DNA疫苗,该疫苗不仅能够有效地激活细胞免疫,还能诱导高水平抗体的产生。向敏等[32]构建了PEDV S蛋白的COE基因真核表达载体,在VERO细胞中瞬时表达,用重组质粒COE核酸疫苗免疫小鼠,在小鼠体内可诱导产生相应的抗体。2014年,梁恩涛等[33]应用真核表达载体构建了表达PEDV S1的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL7207(pVAXDS1),并以每只1×109CFU口服免疫BALB/c小鼠具有良好的安全性,携带的S1基因能在小鼠回肠末端组织内正常转录及表达,为深入开展减毒沙门菌疫苗菌株SL7207(pVAXD-S1)的免疫评价及构建PEDV与其他抗原基因联合免疫DNA疫苗奠定了基础。2014年6月,美国Harrisvaccine公司应用其拥有的独一无二的SirraVax(SM)RNA颗粒技术研制的PED RNA疫苗成为美国农业部的条件性许可的首个PED疫苗[12]。

3.4 亚单位疫苗

亚单位疫苗是采用基因工程的方法将病毒的特定基因重组到合适的质粒或病毒载体中,然后导入原核或真核表达系统进行高效表达,提取所表达的特定多肽,加入佐剂制备而成的一种新型疫苗。表达系统主要有细菌、酵母或动物细胞等,目前国内已有少量商品化的亚单位疫苗,如猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗,羊衣原体病基因工程亚单位疫苗。

2008年,韦显凯等[34]成功构建获得了稳定表达PEDV S蛋白基因片段的3个重组腺病毒rAd-S498—638,rAd-S1—638,rAd-S198—1384,免疫小鼠后可诱导产生较强的PEDV特异性免疫应答。2009年,姜艳平等[35]将应用原核表达系统成功表达了S1、Ps420、S2、S3蛋白,并制备了相应的抗血清,检测结果表明这4种蛋白均有很好的抗原性,4种抗血清都能识别细胞培养的PEDV,其中S1、Ps420抗血清能识别天然的PEDV病毒粒子。2014年,谭博敏等[36]成功构建获得了共表达S1和M蛋白的重组杆状病毒rBacmid-S1-M,试验结果显示,共表达的重组S1和M蛋白产物能够与PEDV多克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性。同年,毕玉敏等[37]在pGEX-6P-1载体中表达了4个具有免疫原性的PEDV S蛋白基因片段(Sa,Sb,Sc和Sd),为后期亚单位疫苗的研制奠定了基础。

2016年,加拿大的Makadiya等[38]应用酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞三种真核表达系统成功表达了分泌型的N端糖基化的PEDV USA∕Colorado∕2013株的 S1蛋白,与Triadj佐剂混合后一起免疫分娩前的怀孕母猪,能够诱导产生S1特异性的IgG和IgA,可以传递给新生仔猪。免疫母猪及其所产仔猪血清中存在较高的中和抗体滴度。给仔猪口服PEDV强毒攻击,与对照组相比,免疫母猪所产的仔猪临床症状轻微,死亡率显著降低。但是,免疫组仔猪和对照组在腹泻、体重和排毒量方面无显著差异,因此S1的亚单位疫苗还不能给暴露于强毒的哺乳仔猪提供完全的保护,尚需进一步改进亚单位疫苗以全面抵抗PEDV的感染。2016年,陈瑾等[39]为了提高PEDV亚单位疫苗的免疫原性,进行了免疫增强剂的筛选研究。选取免疫增强剂 CVC1302、CVC1303与可溶性表达 PEDV S蛋白核心表位 COE的重组蛋白(pQZCOE-LTB)混合乳化制成疫苗,免疫小鼠,检测结果表明,重组蛋白与CVC1303配合使用免疫小鼠能产生显著高于灭活苗(CV777)阳性对照组的IgG和sIgA抗体水平,说明CVC1303免疫增强剂能有效增强该重组蛋白的免疫原性,提高亚单位疫苗免疫效果。

亚单位疫苗无致病性,无需灭活,安全性高,是目前的研究热点,如何使PED亚单位疫苗能够提供完全保护是目前亟待解决的难点。

4 国内近年来审批的PED新疫苗及中试产品

三十多年来,TGE-PED二联灭活疫苗和弱毒疫苗在防制TGEV和PEDV引起的病毒性腹泻中发挥了重要作用。自2010年以来,国内猪病毒性腹泻的大暴发导致了新的疫苗需求,应用新毒株研发的PED联苗应运而生。据农业部兽药注册数据库查询[40],冯力等研制了猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5型)(弱毒华毒株+弱毒CV777株+NX株)三价活疫苗,于2014年12月获得新兽药证书。经过八年的潜心研究,北京大北农科技集团股份有限公司等6家单位联合研发申报的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗(HB08株+ZJ08株)于2015年11月获得新兽药证书。华中农业大学等5家单位应用新毒株研发申报的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(WH-1株+AJ1102株)于2016年10月获得新兽药证书。

目前尚处于临床试验阶段的中试疫苗产品有:华中农业大学等研发的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗(WH-1R株+AJ1102-R株)、四川省华派生物制药有限公司等研发的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(HY株+HZ株)、天康生物股份有限公司研发的猪流行性腹泻灭活疫苗(XJ-DB2株)和广东海大畜牧兽医研究院有限公司等研发的猪流行性腹泻活疫苗(CHYJ株)。

5 国外的PED新疫苗及研发新技术

在日本和韩国,随着PEDV变异毒株的出现,各研究单位和疫苗生产企业正在实施应用新的疫苗株替代之前的毒株制备新型PED疫苗的计划。在美国爆发PED之后,有两种疫苗获得农业部的条件性许可,分别是美国Harrisvaccine公司的PED RNA疫苗和Zoetis公司的PED全病毒灭活疫苗。

目前,在动物疫苗研发领域有两种新技术逐渐被应用[41]。一种是病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)疫苗技术,VLP疫苗的抗原结构类似于天然抗原的构象,模拟野生病毒的结构但不含核酸,不具备感染性,能够诱导长期的免疫和细胞免疫,已被应用于猪圆环病毒2型疫苗和O型口蹄疫疫苗的生产[42-43];另一种是RNA颗粒疫苗,是应用致弱的委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuela equine encephalitis,VEE)作为载体,插入靶基因片段,生产出重组疫苗[44]。美国的PED RNA疫苗就是应用PEDV的S蛋白基因替换VEE病毒的部分基因,使得在短期内应对突发疫情进行紧急接种成为可能。综上所述,国内外PED疫苗的研究已取得了较大进步,从最早的灭活疫苗免疫,仅监测IgG抗体,到重视黏膜免疫中sIgA抗体的作用,提供更加全面的保护。尤其是近三年来,应用新毒株制备的商品化疫苗逐步投放市场,为我国防制PED和病毒性腹泻提供了多种选择。目前,虽然大多数PED口服疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗仍处于研究阶段,但美国PEDV RNA疫苗获得条件性许可应用,为PED的疫苗研发提供了广阔的前景,对未来研制高效、安全的PED新疫苗奠定了基础。

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