猫须草根抗氧化成分提取工艺的优化研究

蔡 旋,薛慧琴,杨 帆,肖长峰,杭怡琼,卢永红∗

(1上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106;2华东理工大学生物工程学院,上海200237)

猫须草(Orthosiphon stamineus)是一种生长在热带、亚热带地区的唇形科肾茶属植物。在东南亚国家如印度尼西亚、马来西亚等广泛分布,我国的海南、广西、云南等也有分布[1]。猫须草提取物已被证实具有自由基清除、抗菌、抗肿瘤和抗炎症等多种生物活性[2]。先前的研究已经证实[3-4],猫须草根、茎、叶基本营养成分及抗氧化成分类似,且都具有良好的抗氧化活性及肠道上皮细胞保护作用,肠道上皮细胞保护作用与抗氧化作用相关,其中根提取物的抗氧化效果最佳。但由于经典的猫须草有效成分提取方法是根据猫须草的茎和叶优化的,采用该方法对猫须草根进行提取时,得率仅9.52%,远低于叶(16.70%)和茎(16.64%)。事实上,猫须草的加工工艺是将猫须草整株拔出,晒干后将茎、叶一起切短,而根部则做丢弃处理,造成了资源浪费。优化猫须草根的提取工艺,将其提取物作为食品或饲料添加使用,既可以充分利用猫须草资源,又可以减缓动物肠道氧化应激,起到保护肠道屏障作用。

猫须草有效成分提取方式已有较多研究,如超临界萃取法[5]、传统的浸提法[6]、超声波辅助浸提法等[7],但针对饲料添加而言,采用超临界萃取法成本略高,而有机溶剂浸提法工艺成熟,设备简单,适合广大中小企业使用。超声波辅助提取技术近年来已经成熟,许多天然产物提取工厂也已经购置;超声波辅助提取可以极大地缩短提取时间,节约生产成本;因此本研究采用有机溶剂超声波辅助提取法,并对提取工艺进行正交试验优化。

对于猫须草有效成分浸提的提取溶剂,Sahib等[8]比较了石油醚、氯仿、甲醇的提取效果,结果表明,甲醇具有最佳的生物活性。猫须草中主要有效成分是酚酸及黄酮类成分,黄酮苷类易溶于水,而黄酮类化合物大多易溶于醇类[9]。因此,针对猫须草抗氧化成分提取时,研究者通常会选择甲醇或乙醇作为提取溶剂,其中以甲醇作为提取溶剂较多见[10-11]。本试验以甲醇-水为提取溶剂,采用超声波辅助,研究不同提取温度、提取时间、甲醇浓度及料液比对猫须草根中有效成分提取的影响,以期优化猫须草根的提取工艺,为猫须草根用于饲料添加剂提供加工工艺依据。

1 材料与方法

1.1 材料

猫须草根于2015年夏购自广西玉林中草药市场,为玉林本地农户种植,当年采摘。猫须草根通风处阴干48 h后,轻拍除去泥土,多功能中药粉碎机粉碎,过32目筛,粉末于干燥器中保存,经直接干燥法测定,含水率为8.52%。

1.2 仪器与试剂

1.3 试验方法

1.3.1 单因素试验

利用控制变量法分别考察甲醇浓度、提取温度、提取时间及料液比对提取率及提取物还原能力的影响。考察甲醇浓度时,甲醇浓度分别设为0%、25%、50%、75%、100%,提取温度为45℃,提取时间为30 min,固液比为1∶60;考察提取温度时,提取温度分别设为25℃、40℃、55℃、70℃、85℃,甲醇浓度为50%,提取时间为30 min,固液比为1∶60;考察提取时间时,提取时间分别设为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min,甲醇浓度为50%,提取温度为55℃,固液比为1∶60;考察固液比时,固液比分别设为1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100,甲醇浓度为 50%,提取温度为 55 ℃,提取时间为 30 min。

提取工艺如下:称取3 g制备好的猫须草根粉末于三角烧瓶中,加入一定量的甲醇∕水提取液,保鲜膜封闭瓶口。在指定温度下,300 W超声,时间依试验要求确定。超声提取结束后,提取液经双层纱布粗过滤,滤液采用抽滤方式三次通过中速定性滤纸(杭州特种纸业有限公司),澄清的滤液转入旋蒸瓶中,滤渣再次以同样工艺抽提,合并两次滤液,以低于55℃温度旋转蒸发浓缩,浓缩液经真空冷冻干燥机干燥。干燥后刮取样品称重,并在干燥器中保存样品,以待后续试验。

分别以得率和抗氧化能力来考察猫须草根提取工艺。

1.3.2 正交试验

根据单因素试验结果,选取合理水平,进行正交试验分析,正交试验流程与单因素试验时一致。

1.3.3 还原能力的测定

在设置土工格栅结构的过程中，需完善施工技术方案，提升整体结构的施工建设水平，保证符合当前的施工发展需求。首先需在基床开挖环节中开展砂垫层的处理工作，逐层进行碾压处理，开始铺设土工格栅[5]。在铺设之后应进行格栅加筋，保证方向受力的均匀性，纵向搭接长度符合标准要求，控制在18cm左右，横向搭接长度控制在10cm左右。且在钢筋搭接的位置上，应使用塑料带开展绑扎工作，按照1.4m的规格开展间隔铺设活动，使用U型钉材料开展固定工作，以免影响工程的施工效果[6]。

样品的抗氧化性能通过测定样品的铁离子还原能力,以维生素C的相当量来表示。称取20 mg维生素 C,定容至100 mL,配制成质量浓度为 200 μg∕mL 的溶液。 分别取 0 mL、0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL,定容至 10 mL,配制成质量浓度为 0 μg∕mL、5 μg∕mL、10 μg∕mL、20 μg∕mL、30 μg∕mL、40 μg∕mL的标准溶液。在试管中混合1 mL不同浓度样品(样品采用50%甲醇配制成1 mg∕mL质量浓度)或标准品,2.5 mL 0.2 mol∕L pH 6.6 PB缓冲液,2.5 mL铁氰化钾溶液(w∕v);50℃水浴20 min;加入2.5 mL TCA(10%,w∕v),混匀,3 000 r∕min离心10 min,收集上清,取2.5 mL上清液与0.5 mL氯化铁溶液(0.1%,w∕v)混合,700 nm下测定吸光值。样品的还原能力以等价维生素C的质量浓度表示。抗氧化能力根据公式:等价维生素C含量(μg)=测得样品溶液维生素等价质量浓度(μg∕mL)÷样品溶液的质量浓度(mg∕mL)×样品的质量(mg)。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 甲醇浓度对得率及抗氧化能力的影响

如图1所示,甲醇浓度对猫须草根提取物的得率和总抗氧化能力均有较大影响,得率随甲醇浓度的升高而降低,而总抗氧化能力在甲醇浓度为0%—75%间先升高,后降低,变化不显著。而100%甲醇提取物无论是得率还是总抗氧化能力均显著低于其他,可以排除该工艺。因此,正交试验甲醇浓度定为0%、25%、50%和75%。

2.1.2 提取时间对得率及抗氧化能力的影响

如图2所示,提取时间对猫须草根提取物的得率和总抗氧化能力均有一定影响,其中提取时间10—20 min间得率及总抗氧化能力差异相对较大,提取时间在30 min以上时差异很小,更长的提取时间也意味着更多的能源消耗,因此正交试验将提取时间定为5 min、10 min、15 min、20 min。

图1 甲醇浓度对抗氧化成分得率及总还原能力的影响Fig.1 Effects of methanol concentration on antioxidant component yield and total reducing power

图2 提取时间对抗氧化成分得率及总还原能力的影响Fig.2 Effects of extracting time on antioxidant component yield and total reducing power

2.1.3 提取温度对得率及抗氧化能力的影响

如图3所示,提取温度对猫须草根提取物的得率和总抗氧化能力均有一定影响,其中提取温度为25℃时,得率及总还原能力均远低于40℃提取时数值,而85℃提取时虽然总还原能力高于70℃时,但甲醇挥发迅速,有一点安全隐患,且从得率上看,并无太大差别,因此正交试验将提取温度定为40℃、50℃、60℃、70℃。有趣的是,一般认为高温会影响提取物的抗氧化活力,但本研究表明,70—85℃温度提取,对猫须草根提取物的还原(抗氧化)能力并无显著影响。

2.1.4 料液比对得率及抗氧化能力的影响

如图4所示,提取料液比对猫须草根提取物的得率和总抗氧化能力均有较大影响,其中料液比为1∶20时,得率及总还原能力均远低于1∶40提取时数值,而1∶100提取时虽然总还原能力及得率均略高于1∶80 时,但高料液比会带来提取成本的巨大提升,因此正交试验将料液比定为 1∶50、1∶60、1∶70、1∶80。

图3 提取温度对抗氧化成分得率及总还原能力的影响Fig.3 Effects of extracting temperature on antioxidant component yield and total reducing power

图4 料液比对抗氧化成分得率及总还原能力的影响Fig.4 Effects of material-liquid ratio on antioxidant component yield and total reducing power

2.2 正交试验

由2.1各因素对提取率及产物还原能力的影响,确定选取4因素进行正交分析,每个因素选取4水平,利用L16(45)进行正交试验,空出第5列做空白误差分析。正交试验安排及结果见表1。

表1 正交试验设计Table 1 Design of orthogonal experiment

由表1可以看出,对得率的影响,甲醇含量＞料液比＞提取时间＞提取温度,最佳提取工艺为4号方案,即:0%甲醇,在70℃温度下,以1∶80料液比提取20 min。由方差分析(表2)可以得知,甲醇含量和料液比对得率有显著影响,而提取温度与提取时间对得率无显著影响。对提取物总还原能力的影响,同样是甲醇含量＞料液比＞提取时间＞提取温度,最佳提取工艺为8号方案,即:25%甲醇,在70℃温度下,以1∶70料液比提取10 min,方差分析结果未提示有显著影响因素。

表2 各因素对提取物得率及总还原能力影响的方差分析Table 2 Variance analysis of effects of factors on extractive yield and total reducing power

本研究比较了不同提取方案对100 μg∕mL的提取物还原能力的影响,结果表明提取物的还原能力随甲醇浓度的升高而升高。经方差分析表明,甲醇浓度对正交试验中提取物的还原能力有显著影响;对甲醇浓度与提取物还原能力进行皮尔森相关分析发现,甲醇浓度与提取物还原能力显著正相关(皮尔森相关系数为0.863,P＜0.01);而由图1可知,随着甲醇浓度升高,得率呈下降趋势;对甲醇浓度与提取得率进行皮尔森相关分析发现,甲醇浓度与提取得率显著负相关(皮尔森相关系数为-0.633,P＜0.01);通过正交试验数据分析得知,得率与还原能力显著负相关(皮尔森相关系数为-0.704,P＜0.01)。在讨论提取方案对提取物抗氧化能力影响时,综合考虑了提取物的得率和抗氧化能力,得到了抗氧化能力最大的提取方案。

制备猫须草根提取物的主要目的是为了得到其具有抗氧化活性的有效成分,因此总还原能力较得率更有价值。本研究认为宜选取得到总还原能力最大的提取方案为最优方案。

为验证此结果的准确性,在最佳条件下进行了3次验证实验,得率为(13.15±0.13)%,等价维生素C还原能力为(11.44 ±0.15)mg∕g。

研究表明,猫须草根抗氧化成分提取工艺简便,成本可控,提取物抗氧化效果良好,是一种潜在的天然饲料添加剂。

3 结论

(1)猫须草根提取的最佳工艺为采用25%甲醇,在70℃温度下,以1∶70料液比以300 W超声波提取10 min。在此工艺下得率为13.15%,也具有最高抗氧化能力。

(2)甲醇浓度是影响猫须草根提取物得率和提取物抗氧化能力的最主要因素,得率随甲醇浓度升高而降低,在0%—50%范围内,提取物抗氧化能力随甲醇浓度提高而降低。

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