实质性派生品种鉴定方法研究进展

褚云霞,陈海荣,邓 姗,黄志城,李寿国

(上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所,上海201403;农业部植物新品种DUS测试(上海)分中心,上海201415)

《种子法》自2000年颁布实施以来,在推动种子市场化、规范化方面起到了巨大的作用。为了推进改革、转变政府职能、充分发挥市场作用,完善知识产权保护、品种审定制度,全国人大主导了《种子法》修订。按现有制度,通过体细胞克隆、系统选育、基因导入、人工诱发基因突变或采用连续回交等简单方式取得的派生系品种同样可以申请植物新品种权,这损害了原始品种权人的利益,降低了原始育种创新者的积极性。政协十二届全国委员会第三次会议第4514号(农业水利类389号)提案提出在《种子法》修订中强化“实质性派生品种和收获物的保护”。但是由于全国人大常委会对此条的争议较大,因此最终通过的修正案并未采纳这一提案。实质性派生品种(Essentially derived varieties,EDV)保护规则是UPOV1991文本与1978文本的重要区别之一,也是UPOV强化保护植物新品种权人的合法权益、应对生物育种剽窃的一项有力措施[1]。随着国际上越来越多的UPOV成员国开始执行1991年文本,UPOV、其他国家以及我国的众多育种家都希望中国尽早加入UPOV 1991文本。目前我国实质性派生品种很多,如无性繁殖的观赏植物或果树主要依靠突变和遗传修饰等方法培育新品种,很多新品种为EDV;水稻(Oryza sativaL)、小麦(Triticum aestivumL)等新育成品种遗传背景同质化严重、模仿重复多,从第56期《农业植物新品种保护公报》中可以看出,在不到2个月时间内,初审合格的24个水稻申请品种中可能一半为实质性派生品种[2]。为了保护原始育种,提高育种水平,尽快满足加入UPOV1991文本的要求,我国实行EDV保护是新品种保护发展的必然趋势。

目前已有包括荷兰、美国、韩国、日本、澳大利亚、欧盟在内的56个国家及组织实施EDV保护规则[3],UPOV与各相关国家限于技术原因,没有就如何判断EDV制定详细的标准。总结不同国家或国际组织对EDV的判定经验,可为中国建立EDV保护制度提供技术支撑。

1 EDV概念

UPOV 1991第14条第5款提出了EDV这一概念,将由原始品种实质性派生,或者从实质性派生品种产生,保留了原始品种基因型或基因型组合产生的基本特性,与原始品种有明显区别,即存在表型上的差异的品种称为EDV[4]。EDV产生方式有多种,如天然或人工诱变、体细胞变异和基因工程等,对于实质性派生品种的判断,主要取决于品种间遗传组成的相似程度,而不论产生新品种的育成方式。如香石竹(Dianthus caryophyllusL.)突变产生的品种与原始品种可存在多个性状的差异。作为EDV,具有以下特征[3]:第一,来源于一个原始品种或派生品种,并且不是原始品种与另一个品种通过杂交获得。换句话说,就是EDV必须是一个品种内进行培育的结果。第二,EDV与原始品种的基因型非常相似,除了实质性派生所具有的区别性差异外,几乎完全相同。第三,具有特异性,如果不能与原始品种进行区别,就不能成为一个新品种。第四,原始品种应该是受保护的品种,如果原始品种不是受保护品种,则EDV的判定没有任何意义。

2 EDV鉴定方法

尽管UPOV分别从法律和技术角度对EDV进行了界定,但在实践中欧盟各成员国对于EDV的举证有不同的做法[3]。通常情况下,由原始品种的育种者证明被指控的品种是从他的品种实质性派生而来,而欧盟的一些国家法院有时会认为由被告证明品种间不存在派生行为显得更为容易。也就是说由原始品种权人还是EDV权人举证证明EDV的问题,还没有达成共识。

判断一个品种是否为实质性派生品种,主要决定于品种间遗传组成的相似程度,需要通过植物的表型特征和基因型特征来评价。多种方法都可验证两个品种间是否存在派生关系,如评估品种间的杂种优势情况或利用形态标记、分子标记等计算遗传相似系数甚至可以通过分析品种系谱图进行推断。

2.1 品种系谱分析法

理论上讲可以通过计算品种间的亲缘系数(f系数)来评价派生关系[5]。f系数是法国数学家Gustave Malecot提出的一种间接测量两个个体的遗传相似性的系数,指两个个体一个位点上的等位基因来源于相同祖先的概率,f系数可以通过检查详细的家谱记录计算。对于已知系谱信息的作物如小麦、水稻等,f系数分析是一种简便的研究派生关系的方法,但这个过程需要品种的详细系谱信息,而原始品种所有人通常并不知道这些信息,并且由于计算f系数是在假定父母本贡献相同,所有祖先种、亲本及其后代品种都是纯合的,不存在选择、突变和基因漂移等的基础上的,所以计算并不能精确,因此该方法已很少应用。

2.2 杂交

通过评估假定的派生品种与原始品种间的杂种优势情况也可证明品种间的派生关系。杂种优势是指杂种一代在个体大小、生长势、繁殖力、环境适应性以及品质、抗性等方面超过亲本的一种遗传学现象[6]。众多研究发现,通常具有较远的亲缘关系的双亲杂交产生的子代具有较强杂种优势,尽管对于遗传距离与杂种优势之间的相关性还没有统一的结论,但在一定范围内,亲缘关系的远近与杂种优势强弱呈现出正相关,因此如果两个品种间不存在派生关系,则杂种优势应该非常明显[7]。

2.3 形态方法

虽然基因型的研究是判断实质性派生品种的有效工具,但是根据EDV的概念,一个EDV应该仅有一个或少数特征与原始品种有差异,而且这些差异性状是由基因引起,在多数情况下,原始品种与派生品种间的差异与基因差异一致。因此,形态性状可以作为判定派生品种的有效工具。遗传学家和统计学家一致认为,使用形态学标记计算距离系数在技术上是可行的,然而这些距离并不总是反映遗传距离或血统关系。此外,使用形态特征由于环境因素影响可能会更加困难,而且耗时长、成本高,不能真实的、准确的反应其后代的遗传变异。如表型可以判断,则不需再进行DNA检测。如海牙地区法院于2005年审结的Astee Flowers v.Danziger案,这是各国法院第一个解释 EDV的案例[8]。在本案中,法院检验了Blancanieves和Dangypmini的形态性状,21个性状有17个不同,依据外形上的差异,判定两品种间不存在派生关系。审理过程中,法院没有采用DNA指纹技术提供的证据,因为对这一案件来说,形态方法已经提供了充分证据,但很多情况下形态性状的观察并不能充分判断一个品种是否为派生品种。

2.4 分子标记

分子标记技术的发展始于20世纪80年代,是直接在DNA水平检测生物间的差异,是遗传变异的直接反映,不受任何环境因素的影响,技术简单、快速、易于自动化,因此近年来应该十分广泛。由于实质性派生品种的鉴别更多的是从基因型角度进行鉴别,相比形态性状,以基因组相似程度來判定较为可靠,也比较容易进行。分子标记可直接反映基因组相似程度,因此分子标记在鉴别实质性派生品种方面具有独到的优势,可以通过大量的标记筛选,指纹图谱的比较,鉴别出两者之间的细微差别并评价相互间遗传关系。众多的分子标记中,应用较多的是扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)、简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)以及单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)。

AFLP技术是1993年由位于荷兰瓦赫宁根的Keygene公司创建的基于PCR的DNA技术[9]。AFLP技术是限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)和PCR相结合的一种技术,既具备了RFLP的稳定性、可靠性又具备了PCR反应的快速高效性,AFLP属于第一代DNA技术,不需事先知道DNA序列信息,扩增的条带多,多态性丰富,实验重复性高,因此这种技术非常灵活,几乎适用于所有作物。同时AFLP具有信息量大,速度快、成本低的优点,广泛应用于遗传多样性分析、品种鉴定、图谱的构建、亲缘关系分析等,也较早用于鉴定EDV[10-11]。尽管AFLP技术比较陈旧,在育种强度高或遗传基础狭窄的作物上效果不好,生成大部分的DNA片段是单型的,没有区分力,但它在基因组信息未知的作物中能很好地鉴定EDV。2004年Vosman等[11]用AFLP技术进行了月季(Rosa chinensis)EDV鉴定研究,结果表明所有的突变EDV相似系数在0.95—1,而非派生品种间的相似系数＜0.80,其中75%的品种对间相似系数＜0.50。Eeuwijk等[12]以46份大麦(Hordeum vulgareL.)品种为试材,用AFLP标记评价了回交亲本与子代间的遗传距离,认为应该将第二次回交子代与亲本间的遗传距离设为派生性评价的阈值。荷兰海牙法庭2009的一个案件则采用了AFLP来进行派生关系的鉴定[13]。

经过比较,国际种子联合会(International seed federation,ISF)认为SSR在派生关系鉴定方面更有效[14]。SSR标记或SNP标记是目前常用的检测实质性派生关系的方法之一,通过特异性引物扩增待测品种的SSR区域,再通过电泳技术或测序检测获得片段的基因型,根据基因型,判断待测品种间的关系。利用SSR标记鉴定派生的研究报道相对较多[15-17]。SSR得到的是片段的长度信息,具有高多态性、共显性、可识别纯合子和杂合子的优点,由于在染色体上的位置已知,因此可以选择覆盖整个基因组且均匀分布的标记。但也存在一些问题,如成本高、片段长度相差过小,可能检测不到,即使是相同长度的片段,其内部的碱基组成也可能不一样,但SSR同样检测不到。

近年来,大量投资和研究获取了许多作物的序列信息,使简单、低成本地系统地筛选特定位置的DNA成为可能。在此基础上发展的SNP技术称为第3代DNA分子标记,SNP具有操作简单、快速、自动化等特点,可以区分两个个体遗传物质的差异。作物特有的SNP检测芯片可同时揭示成千上万的数据,使遗传关系的评价更准确。而采用一代测序检测SNP,更能获得更精确的基因信息。

2.5 高通量测序

基因相似性的进一步研究是直接比较基因组序列。比较每品种的完整基因组序列或部分序列的方法叫做基于DNA序列的基因型分型。最近的一些论文表明在植物中该方法是可行的[18-19]。1977年Sanger法为代表的第一代测序技术推动了基因序列研究的发展,但其通量低,成本高、速度慢的缺点极大地限制了人类揭示基因奥秘的研究。经过不断的技术开发和改进,2005年,Roche公司推出了454 FLX焦磷酸测序平台开创了高通量测序(Next generation sequencing,NGS)技术的先河,随后Illumina公司的Solexa,Hiseq技术和ABI公司的Solid技术相继出现,标志着NGS的诞生[20]。虽然高通量测序技术建立的时间不长,但发展非常快,以其高输出量与高准确性的特性,不仅提供了丰富的DNA序列信息,而且使得测序的费用降低和时间大大缩短。高通量测序不仅可以进行大规模基因组测序,还可用于基因表达分析、鉴定突变基因、转录组分析、非编码小分子 RNA的鉴定、转录因子靶基因的筛选、DNA甲基化和鉴定实质性派生品种等相关研究。2015年方治伟等[21]申请了一项关于测试油菜品种实质性派生关系的发明专利,通过高通量测序和多位点扩增,实现了待测油菜品种内测试区域的大样本抽样,保证了实质性派生关系检测的准确性。可以检测测试区域所有SNP,还可以发现测试区域内SNP之外的变异,如重复数、缺失与插入等,这些都是单个SNP检测无法发现的。

3 EDV鉴定标准

技术进步并不能自动解决EDV鉴定问题。为了区分EDV和非EDV,需要研究多深,遗传相似性达到多少可以认为它可能为原始品种的实质性派生品种,这些问题始终存在。不论是形态标记还是DNA标记进行派生品种鉴定都需要确定实质性派生品种与原始品种间的最小相似系数和不具派生关系的品种间的最大相似系数。只要技术已经被证明是准确的,任何技术都可以用于鉴定派生品种。为了验证技术的准确性,应考虑下列几点[22]:

i.区分能力∕信息量:这取决于研究的广泛性,包括参考品种的代表性。标记是否可能从非EDV中鉴定出EDV?可计算多样性统计参数如PIC值、He、EMR、MI和Rp等来研究标记的信息量。随机选择的标记分析不应该导致不同的结论。

ii.样本的代表性:不管用于遗传相似性研究的DNA标记数量是多少,标记应均匀分布在基因组中并能代表品种的DNA含量,标记最好不要连锁。

iii.重复性:所选的特定技术或DNA标记,具有相同DNA成分的品种基因图谱应该相同。

iv.错误率:每一种技术或仪器或平台都有其缺陷和不足,关键是能从实际遗传多样性中分辩出技术引起的误差。这可通过重复样品分析来获取。EDV研究首先需要一个能评价作物遗传多样性的参考群体,其次需要EDV群体用于调查EDV和非EDV的遗传相似性,同时需要选择适当的标记方法。最后,需要确定计算遗传相似性的方法。

到目前为止,已有使用不同的技术研究基因相似性的报道[15,23-28]。ISF公布了处理实质性派生品种纠纷的指南(见 http:∕∕www.worldseed.org∕isf∕edv.html)。另外ISF依据研究结果确立了部分作物[黑麦草(Lolium perenne)、玉米(Zea mays)、油菜(Brassica campestris)、棉花(Gossypium)和生菜(Lactuca sativa)]的EDV阈值。正如ISF所述,应该认识到,标记系统和特定的标记组合将随着时间的推移和技术的发展而改变。作物的遗传多样性并不是一成不变的,而是随着新品种的培育而不断发展变化。因此,指南中所述阈值和测定技术应该定期检查,必要时进行调整[22]。

3.1 实质性派生品种鉴定标准建立步骤

3.1.1 建立合适的研究群体

在建立鉴定标准前首先需要有一个好的研究群体用于评估作物遗传多样性。其次需要有EDV品种,用于比对EDV∕非EDV间的差别。

3.1.2 选择标记方法

理论上讲,所有研究遗传相似性的方法都可用于派生品种鉴定,但选择标记方法时应该考虑是否可以自由使用并解决ISF文件“技术专家提出的解决ISF EDV纠纷阈值设置的分子标记方法”中列出的几个问题[29],如品种样本量大小、标记的区分能力评价、哪种类型的标记可以使用,如果多种标记可用时还应给出优先顺序,标记可用的最小标准等。

3.1.3 确定计算方法

计算遗传相似系数的方法有很多,有Nei、Rogerst和Hedrick等[30],扩增条带可以1∕0形式记录也可以分子量大小来记录,如果用样品池作为研究对象时将出现一个位点多于2条带的情况又该如何处理?选择不同遗传相似系数导致分析结果存在很大差异[31]。因此选择恰当的计算方法对于准确鉴定派生关系尤为重要。

3.1.4 确定阈值

在所有ISF研究中使用了系谱清晰的品种对为研究对象。当调查遗传多样性时比对近似品种对是很重要的。阈值最好由作物育种者来决定,对遗传多样性和育种方法的更好理解有助于阈值的正确设置。育种方法本身不足以宣布一个品种就是EDV,但EDV判断标准必须根据不同品种进行确定,无法对所有品种适用统一的EDV判定标准。

3.2 实质性派生品种鉴定标准

根据UPOV规定,满足授权条件的品种可以被授予品种权,而不需判定新品种是否是EDV。而法院审理EDV案件时一般会结合特定植物品种确定EDV的判定方法和相应的证据提供责任。一般原始品种权利人需提供证据证明侵权品种可能是EDV,而一旦按鉴定标准进行鉴定发现亲缘关系大于阈值时,则被告需证明自己的品种并非由原始品种派生而来。美国、德国、荷兰、ISF和国际无性繁殖观赏植物与果树育种家协会(International Community of Breeders of Asexually Reproduced Ornamental and Fruit Varieties,CIOPORA)等国家和组织在实质性派生品种鉴定方面进行了大量探索性研究,ISF和CIOPORA还提供了在自愿基础上用于解决有关EDV的争端的解决方案,对各国育种产业产生了重要影响。

植物品种保护国际育种者协会(ASSINSEL,ISF的前身)饲料植物部在1997年开始进行多年生黑麦草EDV评价工具和标准研究,并于1999年提出评价标准初稿。该标准以AFLP为鉴定方法,确立了欧氏平方距离为7作为的临时界限,数据来源于每品种的60个单株和5个引物组合[32]。2009年ISF重新形成了黑麦草实质性派生品种纠纷处理的指南(Guidelines for handling a dispute on essential derivation in ryegrass),改用SSR数据来计算相似系数,并将0.6设为EDV的阈值。

ISF作物部对不同作物进行了研究,分别设置了不同种类EDV的遗传相似系数。如2004年、2007年和2014年分别发布了有关生菜、棉花和油菜、玉米的《实质性派生品种纠纷处理准则》,分别确定生菜Jaccard系数≥96%、棉花亲缘系数≥87.5%、油菜Dice距离≥0.85、玉米Rogers’距离≥91%作为EDV判定的阈值[33]。在无性繁殖观赏植物和果树品种育种领域,所有的变异体、转化子和单性繁殖植物,以及模仿品种都是EDV。找到一个可行的方法证明一个品种是另一个品种的EDV,是对观赏植物育种者的挑战。在EDV案件中,证明被指控品种是否为“实质性派生于”原始品种是极端困难的。CIOPORA认为被控品种与原始品种之间的Jaccard相似系数在0.90和1.00之间,那么其就完成了一个表面上证据确凿的关于被控是EDV的证明。

4 讨论

育种技术的发展,使得定向育种成为可能,也造成了大量EDV的出现。针对原始品种的缺陷对原始品种进行微修饰可以提高市场占有率,延长原始品种的寿命。另外,派生品种还能促进创新增长及品种多元化推广,提高原始亲本的遗传贡献,有利于提高农民福利。如我国大面积推广的水稻品种中,推广面积前10位的两系杂交稻品种,大多是实质性派生品种[34]。但同时由于我国未实行派生品种保护,损害了原始品种权人的利益,降低了原始育种创新者的积极性,也造成修饰性育种的泛滥,不利于农业生产特性的真正改良。另外由于EDV与原始品种的高遗传相似性,大量EDV的存在使遗传基础变窄,不利于进一步的遗传改良,也可能对国家粮食安全构成严重威胁。派生品种泛滥的结果,必然会导致突破性品种越来越匮乏,育种创新减少的恶性循环。派生品种是我国需要解决的重要问题之一。适当的EDV鉴定方法是实行派生品种保护的技术支撑。建立EDV的鉴定方法时需考虑作物种类、本国农业发展水平、经济水平特别是育种技术的水平以及遗传基础、鉴定技术水平等。对于系谱清楚的种如水稻、小麦系谱分析法可以快速、低成本地鉴定EDV,而我国多数农作物育种系谱较为混乱,形态鉴定方法在尚未建立成熟的分子鉴定标准的情况下可发挥重要作用,但形态方法受环境等因素影响,很难区分实质性派生品种而且耗时长,不适于快速鉴定。分子鉴定标准尽管不能包括所有特异性位点,但具有技术简单、快速、易于自动化等特点,成为目前主要的EDV鉴定方法。

为了应对国际发展及保护原始品种育种人的权利,促进创新育种,我国应加大研究力度,鼓励相关育种协会、育种人等组织和参与有关品种EDV判定标准的研制,依据我国育种创新水平和种业发展的实际情况,甚至针对每类作物,建立适合中国国情的以SSR或SNP为主的EDV鉴定技术标准。当然,特定品种的EDV鉴定标准只是用于转移EDV证明责任的工具,而不是EDV的最终判定标准,育种者仍可以通过提供育种系谱或材料来源等方法证明被控品种并非EDV。为了防止育成的品种成为其他品种的EDV,ASSINSEL建议育种者在育种计划前,应慎选育种亲本,在采用较易产生派生品种的方式如诱变等方式进行育种时需格外小心,同时充分掌握品种基因组信息,防止他人侵权或被控侵权,在育种过程中妥善记录,以维护自身合法权益[3]。

[1]周宁,展进涛,陈超.基于UPOV1991年文本有关实质性派生品种权的探讨[J].农业科技管理,2008,27(1):34-36.

[2]陈红,吕波,刘伟,等.基于植物新品种保护视角下的中国水稻育种现状与对策[J].福建农业学报,2011,26(2):304-308.

[3]李菊丹,尹锋林.实质性派生品种判定国际实践及其借鉴[J].安徽农业科学,2013,41(2):930-934,940.

[4]UPOV.Act of 1991 International Convention for the Protection of New Varieties of Plants[EB∕OL].(1991-03-19)[2016-01-20].http:∕∕www.upov.int∕upovlex∕en∕conventions∕1991∕content.html.

[5]KEMPTHORNE O.An introduction to genetic statistics[M].Iowa:Iowa State University Press,1969.

[6]李博,张志毅,张德强,等.植物杂种优势遗传机理研究[J].分子植物育种,2007,5(6):36-44.

[7]NOLI E,TERIACA M S,CONTI S.Criteria for the definition of similarity thresholds for identifying essentially derived varieties[J].Plant Breeding,2013,132(6):525-531.

[8]台湾大学农艺学系种子研究室.荷兰植物品种权实质性衍生品种侵权判例[J].植物种苗电子报,2006(22):1-5.

[9]VOS P,HOGERS R,BLEEKER M,et al.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting[J].Nucleic Acids Res.,1995,11;23(21):4407-4414.

[10]DE RIEK J,CALSYN E,EVERAERT I,et al.AFLP based alternatives for the assessment of Distinctness,Uniformity and Stability of sugar beet varieties[J].Theor.Appl.Genet.,2001,103:1254-1265.

[11]VOSMAN B,VISSER D,VAN DERVoort J R,et al.The establishment of‘essential derivation’ among rose varieties using AFLP[J].Theor.Appl.Genet.,2004,109(8):1718-1725.

[12]VAN EEUWIJK F A,LAW J R.Statistical aspects of essential derivation,with illustrations based on lettuce and barley[J].Euphytica,2004,137(1):129-137.

[13]HAGUE S.The court of appeal in the hague,Judgment in the Case of Danziger“Dan” Flower Farm versus Astee Flowers B.V[R∕OL].(2009-10-20)[2016-01-20].http:∕∕www.vondst-law.com∕files∕Hague_CoA_29_12_09_judgment_Blancanieves.pdf.

[14]滕海涛,吕波,赵久然,等.利用DNA指纹图谱辅助植物新品种保护的可能性[J].生物技术通报,2009(1):1-6.

[15]HECKENBERGER M,BOHN M,ZIEGLE J S,et al.Variation of DNA fingerprints among accessions within maize inbred lines and implications for identification of essentially derived varieties.I.Genetic and technical sources of variation in SSR data[J].Molecular Breeding,2002,10:181-191.

[16]REID A,HOF L,FELIX G,et al.Construction of an integrated microsatellite and key morphological characteristic database of potato varieties on the EU Common Catalogue[J].Euphytica,2011,182:239-249.

[17]RODRIGUES D H,NETO F DE A,SCHUSTER I.Identification of essentially derived soybean cultivars using microsatellite markers[J].Crop Breed Appl Biotechnol,2008,8(1):74-78.

[18]ELSHIRE RJ,GLAUBITZ J C,SUN Q,et al.A robust,simple genotyping-by sequencing(GBS)approach for high diversity species[J].PloS one,2011,6(5):19379.

[19]LU F,LIPKA A E,GLAUBITZ J,et al.Switchgrass genomic diversity,ploidy,and evolution:novel insights from a network-based SNP discovery protocol[J].PloS genetics,2013,9(1):e1003215.

[20]王兴春,杨致荣,王敏,等.高通量测序技术及其应用[J].中国生物工程杂志,2012,32(1):109-114.

[21]方治伟,彭海,陈红,等.一种测试油菜品种实质性派生关系的方法:中国,CN 104805192 A[P].2015-07-29.

[22]UPOV.International Union for the Protection of New Varieties of Plants.Seminar on essentially derived varieties[R∕OL].(2013-12-20)http:∕∕www.upov.int∕meetings∕en∕doc_details.jsp?meeting_id=29782&doc_id=285636.

[23]DENDAUW J,DE LOOSE M,DE RIEK J,et al.Variety protection by use of molecular markers:some case studies on ornamentals[J].PlantBiosystems,2001,135(1):107-113.

[24]HECKENBERGER M,BOHN M,MELCHINGER AE.Identification of essentially derived varieties obtained frombiparental crosses of homozygous lines:I Simple sequence repeat data from maize inbreds[J].Crop Science,2005,45:1120-1131.

[25]HECKENBERGER M,BOHN M,KLEIN D,et al.Identification of essentially derived varieties obtained frombiparental crosses of homozygous lines:II Morphological distance and heterosis in comparison with simple sequence repeat and amplified fragment length polymorphism data in Maize[J].Crop Science,2005,45:1132-1140.

[26]HECKENBERGER M,MUMINOVIC J,ROUPPE VAN DER V J,et al.Identification of essentially derived varieties obtained frombiparental crosses of homozygous lines:III AFLP data from maize inbreds and comparison with SSR data[J].Molecular Breeding,2006,17(2):111-125.

[27]BORCHERT T,KRUEGER J,HOHE A.Implementation of a model for identifying essentially derived varieties in vegetatively propagatedCalluna vulgarisvarieties[J].BMC Genetics,2008,9:56.

[28]NOLI E,TERIACA M S,CONTI S.Identification of a threshold level to assess essential derivation in durum wheat[J].Molecular Breeding,2012,29:687-698.

[29]International Seed Federation.Issues to be addressed by technical experts to define molecular marker sets for establishing thresholds for ISF EDV arbitration[EB∕OL].[2016-01-20].http:∕∕www.worldseed.org∕wp-content∕uploads∕2015∕10∕Threshold_ISF_EDV_Arbitration.pdf.

[30]吕雪梅,杨关福,张细权.RAPD分析中遗传距离计算方法的比较[J].华南农业大学学报,1997,18(增刊):90-97.

[31]KOSMAN E,LEONARD K J.Similarity coefficients for molecular markers in studies of genetic relationships between individuals for haploid,diploid andpolyploid species[J].Molecular Ecology,2005,14(2):415-424.

[32]International Seed Federation.Principles of a Code of Conduct in Essentially Derived Varieties of Perennial Ryegrass[EB∕OL].[2016-01-20].http:∕∕www.worldseed.org∕cms∕medias∕file∕Rules∕EssentialDerivation∕Archive∕Principles_of_a_Code_of_Conduct_in_Essentially_Derived_Varieties_of_Perennial_Ryegrass_(En)_Archives_20080911.pdf.

[33]牟萍.关于实质性衍生品种的三个基本问题[J].电子知识产权,2010(4):74-77,91.

[34]唐力.派生品种对水稻育种创新及运用影响研究[D].南京:南京农业大学,2012.