三维培养在肿瘤细胞生物学研究中的应用

吕东来，陆林，卢虎生，徐秀理，胡宗涛

(解放军第105医院肿瘤诊疗中心，合肥 230031)

综述

三维培养在肿瘤细胞生物学研究中的应用

吕东来*，陆林，卢虎生，徐秀理，胡宗涛

(解放军第105医院肿瘤诊疗中心，合肥 230031)

近年来， 三维培养技术逐渐成为肿瘤细胞培养领域研究的热点，其利用各种方法及材料， 在体外模拟体内微环境培养细胞，使肿瘤细胞呈空间立体方式生长，表现出很多不同于传统二维培养的特点。三维培养为深入研究肿瘤的细胞生物学特性，尤其是药物敏感性这个转化医学的关键点提供了良好的平台，有望成为生物医学体外实验中，传统二维培养和动物实验中的一个桥梁。本文综述了近年来三维培养在肿瘤细胞生物学和药敏试验研究中的应用和进展。

三维培养；肿瘤细胞生物学

肿瘤细胞培养是肿瘤细胞生物学研究的基础技术之一。传统的单层培养技术无法模仿体内肿瘤的三维空间体系结构，导致所培养的细胞在形态、增殖、细胞连接、信号转导、分化等方面与体内生长细胞存在诸多不同。为了更好的模拟体内细胞的微环境，三维培养便在近年里走上了细胞生物学研究的舞台[1]。

肿瘤细胞的三维培养属于细胞生物学和组织工程学的交叉领域，它是传统单层培养技术和肿瘤体内实验的一个桥梁。起初，人们对细胞三维培养的研究目的主要集中在体内损伤组织的修复与替代重建方面[2]，但此后研究陆续发现三维培养状态下的肿瘤细胞在细胞粘附、迁移、增殖和超微结构等方面与二维培养的肿瘤细胞存在显著不同[3]，因此本世纪初Weinberg等知名肿瘤生物学家开始强调三维培养肿瘤模型的重要意义[4]，越来越多的实验中心也开始将三维细胞培养应用在肿瘤基础研究领域，包括临床前药物体外筛选、肿瘤干细胞维持和分化、信号异常转导等方面[5-7]。尤其在少见恶性肿瘤的临床前药敏试验和药物筛选中，利用三维细胞培养这种方法将有效的避免不必要的临床I、Ⅱ期实验，从而减少病人资源和后续研究资金的浪费[8]。本文按照三维培养技术的发展脉络就目前肿瘤细胞体外三维培养的主要方法和其在抗肿瘤药物研究中的作用做简要综述。

1 目前抗肿瘤药物临床前体外实验方法的不足

目前抗肿瘤药物体外实验方法主要是由美国国家癌症研究所（NCI）于上世纪八十年代创建的以检测单层培养细胞对药物的反应来进行，但在临床应用中，常发现体外实验敏感的药物效果与患者体内实体瘤临床评估的药效偏差较大[9]。既有研究表明，这至少部分是由于单层培养的体外细胞生长丧失了三维空间结构，无法相对真实地反映体内肿瘤细胞的病理生理结构、生长状态以及相对耐药耐辐射的肿瘤干细胞水平[5,10]。如三维生长状态下的肝肿瘤细胞可对治疗耐受，且其耐药特征与体内实体瘤相似[11]。三维支架中生长的乳腺癌MCF-7细胞对内分泌治疗药物他莫昔芬的抵抗力强于单层培养的肿瘤细胞[6]。 这些研究都反映出肿瘤细胞所处的微环境将显著地改变药物的效果，传统的体外药物筛选模型应有所发展，应用三维细胞培养来尽可能模拟肿瘤所处的内环境并建立相应体外研究平台应成为抗肿瘤药物筛查研究的一个重要方向。

2 三维成球培养

2.1 静止性悬浮成球培养

该方法是1992年由Reynolds BA等人在从鼠纹状体进行神经干细胞的分离培养中发明的[12]，是目前为止应用最为广泛的细胞三维培养方法。该培养方法的主要特点是人为的创造无血清低粘附性的细胞生长环境，即：①应用无血清、添加高浓度生长因子的培养液，生长因子根据不同的细胞系略有不同，如胶质瘤干细胞的成球培养添加Vit-B27、EGF、bFGF；②应用低粘附性培养皿，如在培养皿底部铺1.5%的琼脂糖，迫使细胞无法贴壁生长。这些细胞球依据不同的肿瘤类型和生长条件，其直径可从20μm至1mm。人们在对其研究中发现悬浮培养的肿瘤细胞球，在细胞形态、生长动力学特点、部分基因表达中展现了很多体内实体瘤的细胞特点，而且肿瘤细胞球也普遍耐药，无论是传统化疗药还是单抗药物[13,14]。目前，悬浮成球培养主要用来富集肿瘤干细胞亚群。在无血清的环境下，分化程度较高的细胞逐渐死亡，具备干细胞潜能的细胞才能长期生存增殖，经过多次传代之后，肿瘤干细胞得到纯化富集[15]。有研究者认为细胞球耐药性升高除了与药物充分进入细胞球内部困难外，还和肿瘤干细胞比例升高相关。

静止性细胞悬浮成球培养的出现极大的拓展了肿瘤细胞三维培养的应用与研究，其优势很明显：①简单易用，直观地从细胞层面上体现了单个细胞在立体环境中的自我更新及分化能力；②能够大量培养，方便进行高通量的药物筛选研究[16]。但缺陷一样明显，最重要的就是仍与体内环境大相径庭。它悬浮生长，无法迁移运动，由单细胞分裂成球而来，无法体现细胞与基质的作用，长期传代成功率极低[17]，并且体内肿瘤细胞也并非无法接触血清。

2.2 液滴悬挂培养

该方法是将少量单细胞悬液滴于培养板上，然后利用微量液体与基质表面的粘附力大于自身重力而不下坠，将培养板倒置，从而产生液滴，细胞便在在液滴尖端液气交界处聚集，增殖并成球生长。该方法由Kelm在2003年发明[18]，它的优点是操作简便，有非常高的成球率，适用于绝大多数类型肿瘤细胞培养[17]。目前已有商业化的专用384孔液滴悬挂培养板[19]。但是它的局限性也很明显：①液滴的体积上限一般为50μl，否则就会下坠，而推荐的培养体积仅10～20μl，这种情况下的细胞培养数量受限，往往难以超过500；②一旦开始培养则无法更换培养液，也难以在中途加药。由于其固有的局限性，所以该方法在抗肿瘤药物实验中使用并不广泛。

2.3 机械运动式培养

所谓机械运动式培养包含了搅拌式生物反应器、旋转式生物反应器这两种培养方法，其共有的特点是利用生物反应器的机械运动使细胞运动悬浮而难以贴壁，从而成球生长。这种培养方式目前多结合微载体或者微囊，以增加细胞生长的效率，提高对细胞的保护[20]。其中，搅拌式生物反应器的发明源于Sutherland上世纪70年代对于肿瘤细胞放疗抵抗性的研究[21]，是最早的细胞成球培养方法，至今仍在使用。该培养法通过叶轮或桨式搅拌器的转动来搅动培养液，流动的液体阻止了细胞贴壁粘附，也确保了氧气和各种养分均匀分布，有利于细胞成球和新陈代谢。其不足之处在于搅拌过程中产生的泡沫及流体剪切力对细胞存在较明显的损伤作用，但若搅拌速度过低则不利于氧气和营养成分的扩散，且细胞容易贴壁。旋转式生物反应器由前者改良而来，它发明于1992年，设计初衷是利用培养器自身的水平旋转，模拟微重力状态，研究这种情况下的细胞生物学特性[22]。现在该装置也较广泛的应用于肿瘤细胞的三维培养。它较前者的优点是可有效的降低流体剪切力带来的细胞损伤，但仍然不能避免细胞与生物反应器壁之间碰撞所造成的细胞机械性损害。

这两种利用机械装置的三维培养模型最大的优点是能产生大量的均一性尚可的细胞球[23,24]，因此目前常用来进行大批量的细胞培养。但是它们的缺点也很突出：①培养后期，生物反应器中的细胞易聚集沉积，不能支持高密度的细胞培养；②两种反应器都是特制的细胞培养装置，使用成本较高；③培养、收集、加药后检测均需要额外的操作步骤，难以进行药效作用动态性和及时性的观测，所以不利于其在肿瘤药敏试验中发挥作用。

3 凝胶包埋培养

细胞成球培养方法虽各不相同，但最后形成三维结构均是细胞球。然而悬浮的细胞球毕竟无法与基质粘附，只能很局限的模拟体内肿瘤细胞生长的部分微环境。而体内肿瘤细胞是与其他细胞和细胞外基质紧密连接的。因此随着研究的深入，更先进的细胞三维培养方法也陆续出现了，其中之一便是凝胶包埋法。凝胶是一种具有高亲水性的聚合物，细胞在凝胶中生长多自发形成球样结构，这时的球体除了细胞与细胞之间的粘附，还存在细胞与细胞外基质的接触，更加的接近体内微环境。

3.1 胶原

胶原是目前用于细胞培养的凝胶中，应用最广泛的材料。作为细胞外基质中最主要的成分之一，胶原对于绝大多数细胞都具有良好的生物相容性。最早应用胶原是用来进行组织培养的。上世纪80年代，有人曾将切割后的肿瘤组织块（直径约1mm）包埋入胶原中进行培养，结果在几个月后，肿瘤组织结构和细胞活力仍保持良好[25]。此后亦有人将其应用于肿瘤组织培养和药敏测试，但类似研究数量很有限[26]。应用胶原基质凝胶进行肿瘤细胞三维培养最早见于乳腺癌细胞的研究，该研究发现凝胶中的癌细胞生长成类似体内肿瘤才能形成的导管样结构[27]。亦有应用胶原基质进行不同肿瘤细胞系培养后药敏作用观测的，发现大多数细胞三维培养后抗药性与单层培养的细胞存在明显不同[28]。

3.2 藻酸盐

藻酸盐来源于褐藻的细胞壁成分，最早被提取出来时人们用其培养肝细胞，发现肝细胞可在其中生长并保持合成白蛋白的功能[29]，反映了其作为培养基质对细胞功能的良好维持性。它最大的优点是可在室温成胶，这样就允许细胞均匀的混入凝胶原液后无损的成胶生长。已有实验用其进行肿瘤细胞三维培养的药物检测，实验中发现多种人乳腺癌细胞系可在藻酸盐凝胶中生长，形成独立的细胞球，这些细胞相比单层培养的细胞具有更强的化疗抵抗性[30]。

3.3 Matrigel

Matrigel是从Engelbreth-Holm-Swarm鼠肉瘤中提取得到的，成分复杂，包含胶原、层粘连蛋白和多种细胞因子与生长因子，可用于包括细胞三维培养、侵袭实验和细胞分化等多种实验[31]。当正常前列腺上皮细胞在其中生长时，细胞会成中空、腺泡样结构；而当前列腺癌细胞在其中生长时，则会形成实体的、紊乱的类球样结构[32]。另外，乳腺癌细胞的Matrigel三维培养中发现，原本在单层培养中相互独立的信号通路，却在三维生长时相互调节[33]。该培养模型的缺陷主要是价格昂贵，且成分多样，不同批次间成分比例不确定，所以较难广泛用于药物筛选实验中。

现在随着材料学的进展，新的凝胶培养基也开始出现。但总的来说，无论哪种凝胶，进行三维培养均能提供一个细胞生长的立体空间和重要的信号模拟，而且未来可根据所研究的不同肿瘤类型来从不同组织中提取相应的细胞外基质成分制备凝胶，以更好的模拟体内情况。但是凝胶包埋培养也缺乏供细胞支撑的交联网络体系，所以肿瘤细胞在其中往往易聚集成球，较少扩散转移生长。

4 三维组织工程支架培养

三维支架是随着组织工程学的发展而出现的，它如同三维立体的“脚手架”，为体外细胞的三维生长提供支架，如同体内的细胞外基质，使细胞生长形成适宜的空间分布和细胞间联系。目前可以应用制备支架的材料有：①天然有机物：胶原、壳聚糖、葡萄糖氨基聚糖类（主要是透明质酸）、丝心蛋白、琼脂糖、藻酸盐及淀粉（主要用来做添加剂）；②无机大分子化合物：聚乙醇酸（polyglycolic acid,PGA）、聚乳酸（polylactic acid, PLA）、聚已内酯（polycaprolactone, PCL）、聚原酸酯（polyorthodester,POE）及它们之间的多相聚合物[34]。前者具有良好的生物相容性，后者虽无生物活性，但有更好的可加工调整性与可复制性。支架的制备要比凝胶复杂得多，而且为了细胞能良好的生长和实验的可重复性，支架的孔隙、机械强度、结构稳定性和降解系数都要求尽量能够控制。目前制备支架的工艺主要有：电喷、冰冻干燥、溶剂浇铸、形状沉积制造、选择性激光烧结、熔融沉积成型和3D喷印等多种方法[34]。其中后3种制备工艺均属于3D打印技术，也将是未来精密支架制作的主要方法。

近年来，陆续有一些应用支架进行三维肿瘤细胞培养的高水平研究见诸报道。Dhiman等人应用壳聚糖支架培养乳腺癌MCF-7细胞，发现细胞在支架上能很好的粘附并增殖，以此进行了对他莫昔芬的药敏试验，结果显示支架上生长细胞的抗药性是单层培养的10倍[6]。戴建武团队应用三维胶原支架进行了相同细胞系的培养，发现细胞在三维支架上生长的恶性表型的显著增强，另外乳腺癌干细胞（CD44+/CD24-）的比例显著增多，细胞成瘤能力明显增强[5]。Mikos等人应用PCL的三维支架培养尤文肉瘤细胞TC-71，结果显示三维培养的肿瘤细胞在生长形态、增殖动力学和多种蛋白表达上都更贴近体内培养的细胞，在IGF-1R和mTOR相关信号通路上与单层培养的细胞都有很大不同，且三维培养的细胞对表柔比星的抗药性远远大于单层生长的细胞[7]。

5 三维培养技术在肿瘤基础研究中的应用前景和未来发展方向

肿瘤细胞所处的三维微环境对细胞的重要作用已经越来越受到学者的重视。从目前的技术进展来看，凝胶和三维支架，尤其是支架在模拟体内肿瘤细胞三维空间结构及所处生长环境中有一定的优势，相对来说能更真实地反映体内细胞-细胞间和细胞-基质间的相互作用。未来的发展趋势包括：①应用更先进的材料和加工科技，让培养基质的各项系数可控可调，依据不同的肿瘤类型和设定的研究目的来制备更加适合三维培养材料，比如研究骨转移瘤时可考虑应用降解系数低的支架，或者可在支架上添加所需的VEGF等生长因子，促进血管拟态及相关药物的研究；②与不同类型的生物反应器结合，如与灌流式生物反应器结合，来解决三维培养中代谢产物或者药物运动扩散受限的情况；③以此为平台建立多种细胞共培养体系，如肿瘤细胞+免疫细胞+内皮细胞共培养等，以明确肿瘤细胞与基质及其他相邻细胞之间同时作用的影响。以上这些都将更好地模拟体内肿瘤细胞真实的微环境情况，有助于我们得出更准确的科学结论。

三维细胞培养从单纯的悬浮成球到现在复杂的组织工程支架培养，都在证明三维培养将在未来肿瘤细胞生物学体外实验中起到越来越重要的作用，尤其在血管生成、干细胞培养以及以此为靶向的抗肿瘤药物研发中有着独特的优势，值得进行更深入的研究。

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Application of three-dimensional culture in tumor cell biology research

Lv Donglai*, Lu Lin, Lu Husheng, Xu Xiuli, Hu Zongtao
(Clinical Oncology Center, The 105 Hospital of The People’s Liberation Army, Hefei 230031, China)

In recent years, in vitro three-dimensional (3D) cell culture technology, which simulates in vivo microenvironment of tumor growth, has become increasingly popular in tumor cell biology research. 3D culture allows in vitro tumor cells to grow in all directions, therefore display different characteristics from the traditional two-dimensional (2D) culture. 3D cell culture provides a good platform for further study on cellular characteristics of tumor, especially on the key area of drug sensitivity in translational medicine,.It holds a great promise to bridge traditional 2D culture to animal experiments, which is essential to advance on tumor cells biology research. The recent progression and advances of 3D cell culture applications in tumor cell biology research and drug susceptibility test are reviewed in this paper.

Three-dimentional culture; tumor cell biology

R730.2

A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 012

2017-04-25

2017-09-25

教育部肿瘤免疫病理学重点实验室开放课题基金资助（2012jsz106）

吕东来，男（1981年），汉族，副主任医师，博士

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：lvxunhuan@163.com