不同脱钙条件下三种脱钙液脱钙效果的比较

陈敬文，张伟，王天娲，程俊，罗金风

（1深圳市人民医院病理科，深圳 518020；2广州军区广州总医院病理科，广州 510010）

不同脱钙条件下三种脱钙液脱钙效果的比较

陈敬文1*，张伟2，王天娲1，程俊1，罗金风1

（1深圳市人民医院病理科，深圳 518020；2广州军区广州总医院病理科，广州 510010）

目的探讨在常温和加温脱钙条件下，甲酸混合液、Alexander硝酸甲醛液及Jenking脱钙液的脱钙效果和染色结果。方法取小鼠膝关节骨组织分为6份，根据脱钙条件和脱钙液的不同，分为常温脱钙组合加温脱钙组两组。常温脱钙组：三种脱钙液常温（25℃）脱钙48h并石蜡切片HE染色；加温脱钙组：三种脱钙液70℃温箱脱钙6h并石蜡切片HE染色，并分别观察骨组织在不同脱钙液及脱钙条件下的脱钙效果及染色结果。结果常温（25℃）脱钙组标本中，经甲酸混合液脱钙的骨组织较难切片，染色较差；经Alexander硝酸甲醛液脱钙的骨组织较易切片，染色较差；经Jenking脱钙液脱钙的骨组织较易切片，染色较好。加温脱钙组标本中，经甲酸混合液脱钙的骨组织较易切片，染色较好；经Alexander硝酸甲醛液脱钙的骨组织较易切片，染色一般；经Jenking脱钙液脱钙的骨组织较易切片，染色较好。结论不同的脱钙液种类及脱钙条件对脱钙及染色结果有较大的影响，标本经三种脱钙液加温脱钙后，使脱钙时间大大缩短，减少了酸对组织的破坏，在脱钙效果及染色结果方面，均要优于常温脱钙，而Jenking脱钙液无论在常温和加温条件下的脱钙和染色效果均要优于其它两种脱钙液，有一定的应用价值。

脱钙液；脱钙方法；骨组织制片

在组织切片过程中，一些组织内含有骨质或钙化时，较难切出完整的切片。对于这些组织必须进行脱钙处理后，才能进行切片染色。一般脱钙过程需要2天左右，如果骨及钙化组织密度较高，则需要更长的脱钙时间，会降低工作效率。在脱钙过程中往往需要用酸进行长时间处理，而酸在脱钙的过程中必然会对组织造成一定程度的损伤，且脱钙时间越长，损伤程度就越大，必然会对后续的病理制片及病理诊断造成一定的影响。用于脱钙的酸的种类繁多，脱钙效果及脱钙时间又不尽相同，如何选择一种合适的脱钙液，并尽量缩短脱钙时间，显得至关重要[1]。作者选择几种常用的脱钙液，在不同的温度条件下进行脱钙处理及切片染色，并观察几种脱钙液在不同条件下的脱钙效果及染色结果，现总结报告如下。

材料和方法

1 主要仪器及试剂

Leica2245石蜡切片机（Lciea公司，德国），Leica PEORISII脱水机（Lciea公司，德国）；DHG-9023A电热恒温干燥箱（上海一恒科技公司）。甲酸混合液（甲酸20ml，10%甲醛5ml，蒸馏水75ml）；Alexander硝酸甲醛液（硝酸7ml，甲醛5ml，蒸馏水100ml）； Jenking脱钙液（浓盐酸4cm，冰醋酸3cm，氯仿10ml，无水乙醇73ml，蒸馏水10ml）[2]；Harris苏木素（苏木素2.5g，无水乙醇25ml，钾明矾50g，蒸馏水500ml，黄色氧化汞1.25g，冰醋酸20ml）；1%水溶性伊红乙醇液（伊红1g，蒸馏水75ml，95%乙醇25ml，冰醋酸0.5ml）。

2 标本来源

购自作者单位实验中心实验用健康小鼠，脊髓脱臼法处死，取膝关节骨组织，分为6份，根据脱钙温度和脱钙液的不同，分为常温脱钙组和加温脱钙组。

3 标本处理及染色方法

小鼠膝关节骨组织6份，分别入三种脱钙液，常温脱钙组将标本于常温（25℃）下脱钙48h，加温脱钙组将标本于70℃恒温箱内脱钙6h，两组脱钙标本在脱钙结束后取出，流水冲洗6h，脱水机常规脱水处理并石蜡包埋，石蜡切片厚4μm，70℃烤箱烤片20min，二甲苯I脱蜡5min，二甲苯Ⅱ脱蜡5min ，无水乙醇1min，95%乙醇1min，85%乙醇1min，75%乙醇1min，自来水洗2min，蒸馏水洗2min，Harris苏木素5min，自来水洗1min，75%盐酸乙醇液分化30s，自来水洗5min，1%伊红液1min，95%乙醇I1min，95%乙醇Ⅱ1min，无水乙醇I1min，无水乙醇Ⅱ1min，二甲苯I1min，二甲苯Ⅱ1min，中性树胶封片。

结 果

常温脱钙组中，骨组织经甲酸混合液脱钙后制片较难，染色较差；经Alexander硝酸甲醛液脱钙后制片较易，染色较差；经Jenking脱钙液脱钙后制片较易，染色较好。加温脱钙组中，骨组织经甲酸混合液脱钙后制片较易，染色清晰；经Alexander硝酸甲醛液脱钙后制片较易，染色一般；经Jenking脱钙液脱钙后制片较易，染色较好（图1）。常温脱钙及加温脱钙制片及染色效果对比见表1和表2。

图1 骨组织不同温度下3种脱钙液脱钙HE染色效果比较。比例尺，50μmFig. 1 Comparison of three decalcification agents on decalcification and HE staining effects at different temperatures. Scale bar, 50μm

表1 常温（25℃）条件下三种脱钙液脱钙效果及染色结果Tab. 1 Decalcification efficiency and staining results of three decalcification agents at normal temperature (25℃)

表2 加温（70℃）条件下三种脱钙液脱钙效果及染色结果Tab. 2 Decalcification effect and staining results of three decalcification agents at increased temperature (70℃)

讨 论

骨组织是一种坚硬的结缔组织，内含有大量无机盐，主要是羟磷灰石-磷酸钙和碳酸钙。病理组织中所见的钙盐类沉着，多为结核及其他各种坏死灶和某些肿瘤组织内。骨及钙化组织在病理诊断中具有重要意义：如骨发生的各种肿瘤、以及各种组织的钙化（如结核病干酪性坏死灶的钙化，脂肪组织坏死等产生的钙化）、在病理性钙化及骨化的病理诊断和研究（各种陈旧病灶的钙化、骨折的修复、骨化性肌炎、陈旧性瘢痕组织骨化的观察）、在某些骨性肿瘤及畸胎瘤的诊断和鉴别诊断（如钙化上皮瘤、脑膜瘤、卵巢浆液性囊腺瘤、子宫平滑肌瘤、甲状腺乳头状瘤及畸胎瘤）等[3]。

骨和钙化组织一般不能直接切片，必须先脱去钙质，合理的脱钙时间和脱钙液，是完成骨组织切片的关键。脱钙过程中往往需要酸的处理，用于脱钙的酸的种类繁多，脱钙效果及脱钙时间也各不相同，酸在短时间内可脱去大量的钙，但酸对组织脱钙的同时也会对组织产生酸化，骨组织在脱钙液中时间的长短会影响后续切片及染色的效果；如何选择一种合适的脱钙液，及尽量缩短脱钙时间，显得至关重要。

在我们所选择的三种脱钙液中，甲酸性质温和，对组织的破坏程度较轻，但甲酸的作用较弱，脱钙速度较慢，在常温脱钙组实验中，相同脱钙条件下脱钙后，脱钙效果不如其它两种脱钙液，制片不易，染色效果一般[4]。在加温钙组实验中，骨组织经加温脱钙后，脱钙效果明显提升，制片容易，且组织结构完整，染色也较满意。

硝酸是一种广泛使用的脱钙液，其脱钙能力强，脱钙时间短，但对组织损伤大，脱钙时间不易过长，否则会引起组织的破坏，影响染色效果。经硝酸脱钙后组织肿胀明显，细胞核的染色能力下降，组织细胞的形态结构难以保持完整清晰，对比度差[5]。从实验结果可以看出，常温条件下硝酸脱钙完全，组织制片容易，但因脱钙时间过长，酸对组织损伤较大，染色效果不理想；加温脱钙条件下使脱钙时间缩短，减少了酸对组织的损伤，不但骨组织能够脱钙完全使制片容易，而且染色效果相对常温脱钙也得到了提高。

Jenking液是一种混合脱钙液，脱钙液中的盐酸作用温和，对脱钙组织造成的损害小，不会使组织膨胀，冰醋酸可使骨组织软化，有利于切片；在脱钙液内加入氯仿可防止脱钙组织因脱钙后导致切片染色偏红，甲醛不但在脱钙的时候能同时固定组织，还可适度保护组织免受酸的侵蚀。这种脱钙液对组织损伤小，脱钙时间短，脱钙后所制作的组织切片结构显示清晰，切片中的软组织和骨组结构均完整显示，细胞核染色清晰，核质对比鲜明[6]。由实验结果可以看出，在常温脱钙和加温脱钙两组实验中，骨组织脱钙效果都较好，组织制片容易，结构完整，染色清晰，对比鲜明，无论脱钙效果及染色方面，都取得了较为满意的结果。

我们的实验结果显示，由于脱钙液的种类不一样，脱钙的效果及对组织的损害也不一样。在同等条件下，酸的脱钙性能越强，脱钙所用时间越短，脱钙也比较彻底，但对组织的损害也就越大，染色也会越差；酸的脱钙能力弱，对组织的损害小，但脱钙效果不太理想，会影响切片，如在实验中所选择的三种脱钙液中，硝酸和甲酸两肿脱钙液，硝酸脱钙能力强，脱钙彻底，切片容易，但染色较差；甲酸性质温和，对组织损伤小，但脱钙效果不如硝酸，会影响切片；Jenking脱钙液中的盐酸和冰醋酸作用温和，对组织损伤小，但综合脱钙能力强，且加入氯仿可保护组织并提高染色质量，无论制片还是染色都能取得满意结果。在实验中发现，加温条件下的脱钙时间明显小于常温条件下脱钙，一般常温脱钙需要48h左右，而加温脱钙一般6h左右就能脱钙完全，说明温度在脱钙过程中起到了一定的作用[7]。加温不但脱钙效果较好，制片更容易，而且减少了酸对组织的损伤，染色结果也较好，而且加温脱钙能使脱钙时间缩短，能大大提高工作效率。

需要注意的是，骨组织脱钙应先固定后脱钙或固定脱钙同时进行，否则未经固定的骨组织在酸性脱钙液中会受到更大的损伤，镜下观察组织会模糊不清，甚至根本看不到细胞结构。脱钙程度的控制应在不影响组织切片的情况下尽量缩短脱钙时间，以免造成因脱钙时间过长引起组织损伤影响染色结果或脱钙时间不足导致的切片困难。在组织脱钙后，要立即将组织中的酸中和掉，采用碱性处理液中和或流水冲洗处理的方法均可，以免染色时组织红染而影响切片染色质量及病理诊断。

[1] 胥维勇，杨群. 脱钙方法与脱钙液的选择及应用. 中国组织化学与细胞化学杂志，2002，11（3）：263.

[2] 龚志锦，詹镕洲. 病理组织制片和染色技术. 上海科学技术出版社，1994（1）：51-52.

[3] 罗灿峤，莫木琼，钟觉民. 不同的脱钙液在骨组织制片中的比较应用. 中国实用医药，2011，6（19）：27-28.

[4] 黄勋福，毛荣军，房惠琼，等. 骨组织甲酸脱钙浓度探讨. 实用医技杂志，2009，16（3）：226.

[5] 王红梅，赵春玉，牟阳，等. 改良的硝酸脱钙液HE制片方法探讨. 实用肿瘤学杂志，2005，19（2）：151-151.

[6] 龚志锦，詹镕洲. 病理组织制片和染色技术. 上海科学技术出版社，1994（1）：282-283.

[7] 张婉仪，阮君，丘展龙，等. 骨组织病理制片三种脱钙液的比较. 吉林医学，2014，35（10）：2083-2084.

Comparison for decalcifying effect of three decalcification reagents in the bone tissue

Chen Jingwen1*, Zhang Wei2, Wang Tianwa1, Cheng Jun1, Luo Jinfeng1(1Department of Pathology, Shenzhen People’s Hospital,Shenzhen 518020, China;2Department of Pathology Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010, China)

ObjectiveTo compare decalcification and subsequent staining effects of 20% formic acid, Alexander nitric acidformaldehyde solution and Jenking decalcification solution under normal and increased temperature.MethodMouse knee joint bone tissues were obtained and divided into 6 groups∶ 3 decalcification agents under either room temperature (25°C) or increased temperature(70°C). The decalcification lasted 48 and 6 hours for normal and increased temperature groups respectively, followed by paraffin section and HE staining. The decalcification efficiency and staining results were evaluated. ResultAmong those that were decalci fi ed under normal temperature, bone tissues were most difficult to slice in 20% formic acid treated group and HE staining worked best in Jenking decalcification solution treated group. With increased temperature, bone tissues were easier to slice in all groups than they were under normal temperature. Overall the HE staining was good except in Alexander nitric acid-formaldehyde solution group.ConclusionDifferent decalcification agents and conditions directly Influence decalcification efficiency and staining effects. Increasing temperature not only shortened decalcification time and reduced tissue damage by acids, but also showed better decalcification and staining results than normal temperature. Jenking decalcification solution, which was superior in all criteria, had potential application value.

decalcification agent; decalcification method; bone tissue section

R361.2

A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 018

2017-03-21

2017-10-08

陈敬文，男（1978年），汉族，主管技师

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：a780916@163.com