复方补骨脂酊高效液相色谱指纹图谱研究

曹丽萍，刘志承，李曙光，梁 奇，江 霞，刘佳妮

（1.广东省深圳市宝安中医院，广东 深圳 518133； 2.广东省深圳市中医院，广东 深圳 518033；3.广东医学院，广东 东莞 523808）

复方补骨脂酊高效液相色谱指纹图谱研究

曹丽萍1，刘志承2，李曙光2，梁 奇1，江 霞2，刘佳妮3

（1.广东省深圳市宝安中医院，广东 深圳 518133； 2.广东省深圳市中医院，广东 深圳 518033；3.广东医学院，广东 东莞 523808）

目的建立复方补骨脂酊的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，对10个不同批次的复方补骨脂酊进行质量评价。方法色谱柱采用安捷伦TC－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），乙腈－0.2%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL／min，柱温为35℃，检测波长为254 nm；进样量为10 L。结果通过测定10批复方补骨脂酊的HPLC图谱，建立了指纹图谱的共有模式，HPLC指纹图谱共有峰43个，相似度为0.965～0.999；对共有峰进行了归属，并确认了补骨脂素、欧前胡素、丹参酮ⅡA。结论该法准确、可靠，重复性好，可为评价复方补骨脂酊的质量提供科学依据。

复方补骨脂酊；高效液相色谱法－二极管阵列检测器；指纹图谱；补骨脂；丹参；白芷；红花；补骨脂素；丹参酮ⅡA；欧前胡素

复方补骨脂酊是深圳市中医院的院内制剂，方以补骨脂为君药，温肾助阳，外用消斑祛风；臣以丹参活血化瘀；佐以白芷活血生肌、红花活血养血。其以活血养血为主，达到温通气血、营卫调和之功，主要用于治疗白癜风及各种白斑、斑秃、脱发。白癜风发病机制目前仍不清楚，以补骨脂为主药进行组方治疗白癜风的报道较多[1－2]。复方补骨脂酊临床使用多年，医生、患者反映疗效良好，拟对其进行深度开发。该品种原质量标准仅有补骨脂素的薄层色谱鉴别，不利于质量控制。为此，本研究中对其指纹图谱进行研究，为其质量标准提高提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪，包括SPD－M20A二极管阵列检测器，SIL－20A自动进样器，LC－20AT二元梯度泵，CTO－10AS柱温箱，LC－solution色谱工作站(日本岛津公司）；AUW220D型电子天平（十万分之一，日本岛津公司）；LVO－6090LC型真空干燥箱（上海龙跃仪器设备公司）；ICQ－250－DST型超声仪（40 kHz，上海跃进医用光学器械厂）。

1.2 试药

补骨脂素、欧前胡素、丹参酮ⅡA对照品（批号分别为110739－201416，110826－201214，110766－201520），补骨脂、白芷、丹参、红花对照药材（批号分别为121056－200904，120945－201309，120923－201414，120907－201111），均购于中国食品药品检定研究院；复方补骨脂酊（深圳市中医院制剂科自制，批号分别为20151001～20151010，编码为 S1～S10）；水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯（默克公司），其余均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：安捷伦 TC－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈(A)－0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱（0～5 min，12%～22%A；5～17 min，22%～35%A；17～40 min，35% ～50%A；40～70 min，50% ～65%A；70～90 min，12%A）；柱温：35℃，检测波长：190～800 nm，流速：1 mL／min；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

对照品溶液：精密称取补骨脂素、欧前胡素及丹参酮ⅡA对照品适量，分别用甲醇溶解并定容至容量瓶中，配成单个对照品贮备液，分别精密量取各贮备液适量，置同一容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成含补骨脂素、欧前胡素、丹参酮ⅡA质量浓度分别为 41.73，10.50，41.34 μg／mL的混合对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

对照药材溶液：取上述补骨脂等对照药材适量，分别按供试品制备工艺制成对照药材溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

供试品溶液：取S1～S10批复方补骨脂酊，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 指纹图谱的方法学考察

精密度试验：取复方补骨脂酊，按2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样，连续进样6次。结果计算所得谱图的相似度大于0.95，相似度的 RSD小于0.41%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取复方补骨脂酊，按2.2项下制备供试品溶液，室温放置，分别于0，3，6，9，12，24 h时进样，按拟订色谱条件进样。结果计算所得谱图的相似度大于0.95，相似度的 RSD小于0.60%（n＝6），表明供试品溶液稳定性良好。

重复性试验：取同批次复方补骨脂酊6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样。结果6份样品所得谱图的相似度大于0.95，相似度的 RSD小于0.46%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.4 指纹图谱的建立和相似度计算

取10批样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样，得到10批复方补骨脂酊的HPLC指纹图谱，通过保留时间和紫外光谱图分析，得到43个共有峰，色谱图见图1。采用中药指纹图谱相似度软件（2004A版）对10批不同批次的复方补骨脂酊指纹图谱数据进行处理，以中位数法多点校正生成对照指纹图谱，建立共有模式，10批样品与对照指纹图谱间的相似度见表1，均大于0.90，表明10批不同样品具有良好的相似性。

2.5 指纹图谱定性分析

取样品溶液、对照药材溶液及对照品溶液，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样，得到色谱图（图2和图3）。对共有峰进行归属，其中14号峰补骨脂和白芷均有贡献，15号峰丹参和红花均有贡献，27，39号峰补骨脂和丹参均有贡献，14，16～20，27～33，35，38～39，41～42号峰出自补骨脂，12～13，15，27，39，43号峰均出自丹参，13～14，21，25～26，34，36～37，40号峰出自白芷，1～11，15，22～24出自红花，确定其中16号峰为补骨脂素，34号峰为欧前胡素，43号峰为丹参酮ⅡA。

图1 10批复方补骨脂酊指纹图谱色谱图

表1 10批复方补骨脂酊的相似度

图2 对照品溶液高效液相色谱图

图3 样品高效液相色谱图

3 讨论

3.1 检测波长选择

中药成分复杂，不同成分在不同波长下有最大吸收。张昀等[3]采用246 nm和260 nm切换波长测定补骨脂素等成分含量，黄超等[4]研究丹参的指纹图谱时选择280 nm，张翠英等[5]测白芷指纹图谱采用检测波长254 nm，胡燕等[6]采用检测波长270 nm建立红花指纹图谱。本试验中采用PDA检测器在190～800 nm波长对样品进行了全波长检测，结合文献，选择不同波长下图谱进行比较。结果显示，254 nm波长处得到的色谱峰数目较多，信息较全面，且色谱峰分离度良好，故选择254 nm作为检测波长。

3.2 流动相选择

考察了以乙腈－水、乙腈－0.2%磷酸水和甲醇－0.2%的磷酸水溶液为流动相系统，以不同洗脱梯度进行试验。结果表明，乙腈－0.2%磷酸水溶液作为流动相时色谱峰分离度最好。

3.3 指纹图谱的评价

建立的复方补骨脂酊的HPLC指纹图谱中，共有43个共有指纹峰，各指纹峰的相对保留时间和相对峰面积较稳定，所建立的方法有较好的重复性、精密度和稳定性。将共有峰与对照药材进行对比，确定了共有峰的归属，通过与对照品色谱峰比较，确定代表峰的成分。

中药制剂成分复杂，仅通过测定其中一个或几个有效成分的含量不能完整、全面地反映该制剂的内在质量。本试验中通过HPLC－PDA技术，建立了复方补骨脂酊谱指纹图谱，并通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统对其进行分析，建立了对照指纹图谱，为复方补骨脂酊质量控制提供了依据。

[1]廖建生，刘兴文，卢海燕.中药复方白斑膏的组方原理[J].中国药业，2008，17（14）：72－73.

[2]罗瑞雪，徐 坚.高效液相色谱法测定白癜精药散中补骨脂素和异补骨脂素的含量[J].中国药业，2005，14（4）：50－51.

[3]张 昀，刘 路.切换波长HPLC法同时测定大鼠体内补骨脂3种有效成分[J].中国药房，2014，25（31）：2 887.

[4]黄 超，陈科力.滇丹参与丹参脂溶性成分指纹图谱的比较研究[J].中国药师，2015，18（8）：1 256.

[5]张翠英，李振国，王青晓.白芷饮片HPLC指纹图谱研究[J].中药材，2007，30（11）：1 374.

[6]胡 燕，王文波，宋力飞，等.红花HPLC指纹图谱研究[J].湖南中医杂志，2013，29（3）：110.

Study on the HPLC Fingerprint of Compound Buguzhi Tincture

Cao Liping1,Liu Zhicheng2,Li Shuguang2,Liang Qi1,Jiang Xia2,Liu Jiani3
(1.Bao′an Chinese Medicine Hospital,Shenzhen,Guangdong,China 518133; 2.Dongguan Chinese Medicine Hospital,Shenzhen,Guangdong,China 518033; 3.Guangdong Medical College,Dongguan,Guangdong,China 523808)

Objective To establish the chromatography fingerprint of Compound Buguzhi Tincture with HPLC and to evaluate the quality of Compound Buguzhi Tincture from 10 different batches.M ethods AgilentTC－C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)was used,the mobile phase was acetonitrile－0.2% orthophosphoric acid,the flow rate was 1.0 mL／min，the column temperature was 35℃，the detected wavelength was at 254 nm,and injection volume was 10 μL.Results The chromatography fingerprint of Compound Buguzhi Tincturefrom 10 different batcheswasestablished.In thechromatography fingerprint with HPLC of Compound Buguzhi Tincture, 43 common peaks were demarcated and the similarities of Compound Buguzhi Tincture were between 0.965－0.999.Psoralen,imperatorin,and tanshinoneⅡAwere identified.Conclusion The method is accurate,reliable and with good reproducibility,and can be used as the evidence for the quality evaluation of Compound Buguzhi Tincture.

compound buguzhi tincture;HPLC－PDA;fingerprint;psoraleae fructus;salviae miltiorrhizae radix et rhizoma;angelicae dahuricae radix；carthami flos;psoralen;tanshinoneⅡA;imperatorin

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2016)24－0024－04

曹丽萍(1986－)，女，硕士研究生，主管中药师，研究方向为中药学，（电话）0755－29629333（电子信箱）30137721＠qq.com；刘志承(1966－)，男，硕士研究生，主任中药师，研究方向为中药学，本文通讯作者，（电话）0755－83001884（电子信箱）liuzhch66＠sohu.com。

2016－01－22；

2016－08－01)