质谱在乳头溢液中的应用进展

安丽营 李杨 杨斌

130021吉林大学第一医院基因诊断中心1

130033吉林大学第三医院乳腺外科2

质谱在乳头溢液中的应用进展

安丽营1李杨2杨斌2

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乳头溢液在临床中较常见。本文就乳头溢液的定义、产生的原因、常用乳头溢液的检查方法进行综述，重点总结质谱在乳头溢液中的应用。

乳头溢液；检查方法；质谱

乳头溢液产生的原因

乳头溢液是指乳头自然流出液体。乳头溢液包括生理性溢液和病理性溢液。生理性溢液是指哺乳期或产褥期乳头自然流出的乳白色液体，如乳汁。病理性溢液是指非哺乳期或产褥期乳乳头流出的液体。病理性溢液主要分3类，一类是乳管自身病变，囊肿或乳管上皮细胞增生，在乳管内形成一个或多个乳头状瘤或乳头状癌；一类是下丘脑垂体腺瘤，泌乳素分泌紊乱，形成溢液[1]；另一类是服用某些药物导致溢液，如镇静药、口服避孕药等[2]。

乳头溢液颜色

乳白色溢液：可见于生理性的乳头溢液，即哺乳期乳头溢液。多见于哺乳期或哺乳期过后回乳不彻底的女性。在未扩开乳管的情况下，轻轻挤压乳房即可有乳汁产生；还可见于停止哺乳几年后的女性，乳汁形成囊肿，扩开乳管后，可有乳汁从乳头排出，少见于在任意年龄由于机械刺激而产生乳汁样溢液；乳白色溢液还可见于病理性乳头溢液，多见于停止哺乳多年，在未扩开乳管的情况下，挤压乳房可见黏稠乳白色液体从乳头流出，主要原因一是垂体病变导致泌乳素分泌异常增高，二是长期服用镇静药、避孕药。

有色溢液：有色溢液包括淡黄色血清样溢液和血性溢液。有研究表明，这两种颜色的乳头溢液具有相同的临床意义[3]。70%的有色溢液患者经病理诊断为乳头状瘤，10%的有色溢液为乳头状癌。

无色水样液单孔或多孔无色水样溢液，并不少见，多为乳管扩张所致。

乳头溢液的检查方法

乳腺X线照相术：乳腺X线照相术是较早的应用于乳腺的检查，通过观察X线片上钙化、肿块形态、大小和位置可查明乳头溢液原因[4]。其优点：①快速简单。②价格便宜。

缺点：①有一定的局限性，区分乳头溢液良恶性的敏感度约20%～25%[5～7]，即便乳腺X线片提示乳头溢液结果为阴性，也不能排除其是恶性的可能。②暴露于X线的剂量不可避免，多次照射会增加诱发乳腺癌症的风险，尤其是携带BRCA1/2易感基因的年轻女性。③在乳腺X线照相时挤压乳头，给患者带来一定的疼痛和不适。④年龄＜40岁者不建议使用，年龄在40～49岁的使用存在争议：年轻女性的乳腺组织稠密，降低了乳腺X线照相术的敏感性。

乳腺超声：乳腺超声是大部分患者的首选检查，应用较乳腺X线照相术晚。主要是通过超声波获得声像图，根据声像图上回声的强度、声影来区分乳腺的良恶性。其优点：①更加便捷。②对乳管内病理性乳头溢液敏感性要好于乳腺X线照相术。研究表明，其敏感性约60%，特异性约75%～85%。

缺点：①不能连续探测乳管内的情况。②当周边乳管内肿瘤较小时，不易探测到。③不能区分乳管内肿瘤的性质。

乳腺导管造影术：乳腺导管造影术早于乳腺X线照相术和乳腺超声。通过溢液乳管注入造影剂，来探测和定位乳管内的肿瘤。其优点：①定位乳管内的肿瘤在乳管的位置。②当乳管内有肿物时，注入造影剂可缩小乳腺腺体的切除范围。

缺点：①当溢液乳管不溢液时，无法行造影术。②造影剂会引起部分患者过敏，发生过敏反应，给患者带来不必要的痛苦。③不能区分乳管内肿物的良恶性。

细胞涂片检查：乳头溢液涂片检查是存在争议的，现在不推荐作为常规的检查方法。其优点：①操作过程简单，即涂片、固定、染色。②涂片取样是无痛的。③若图片结果为阳性，可做出病因学的诊断。

缺点：①经研究证实其敏感性低，需重复操作，多次进行复检[8]。②需要有经验的细胞学专家采集样本。③细胞学结果和乳管损伤缺乏相关性。

乳管内镜检查：乳管内镜检查技术在最近20年来发展迅速。我国在1988年从日本引进，由内镜和放大60倍的显示器组成，主要应用于对乳头溢液的检查。优点：①对乳头溢液的患者，乳管镜可直接从溢液的乳管开口处进入，可在直视下连续观察乳管形态。②可明确乳管内肿物形态及深度。③可收集溢液乳管的灌洗液，行细胞学检查。灌洗液的细胞学检查结果与乳管镜下观察到的形态有关联[9]。④对于乳管内占位病变可行活组织病理检查。⑤通过探针定位病损乳管，缩小手术切除范围。

缺点：乳管在常态下处于闭合状态，扩开乳管时，部分患者感到疼痛。

质 谱

质谱又称质谱法，是一种与光谱并列的谱学方法。质谱分析法是化合物形成离子和碎片离子，按照其质/荷比的不同进行分离测定，对其结构和成分分析的一种分析方法。其基本原理是样品中组分在离子源中发生电离，生成不同质/荷比的带电离子，在加速电场的作用下，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中利用电场和磁场的作用，将其分别聚焦，形成质谱图，从而确定所测物质质量。质谱的优点多，例如应用范围广泛、灵敏度及特异度高、所需样品少等。质谱仪的种类很多，根据应用范围的不同，主要包括有机质谱和无机质谱。有机质谱有气相色谱-质谱联用仪、液相色谱-质谱联用仪、基质辅助激光解析飞行时间质谱仪；无机质谱有火花源双聚焦质谱仪、感应耦合等离子体质谱仪、二次离子质谱仪，还有质谱联合应用等多种类型。

质谱的应用范围非常广泛。其中质谱成像技术在生物医学和生命科学领域中的应用技术较成熟[10]。在生物化学方面，质谱可以被用来研究多糖的结构和多糖在生物系统中的功能，尤其是在糖蛋白的分析上。在过去的10年里，质谱让人们对糖类在生物中的作用有了更深的认识[11]。在微生物学方面，应用质谱探测微生物的代谢分子，并且应用多种质谱技术，不仅使人们在微生物分子水平上的认识更加深入，更使人们对微生物的化学世界有了前所未有的洞悉[12]。在临床医学方面，质谱应用于鳞状肺癌切除术术中，用于确定切除肿瘤后瘤周组织的切除范围。传统的方法是以冰冻组织病理结果作为金标准，但其存在一个缺点，即复杂的分析流程。整个过程需要30～40 min。而质谱可以实时地在1 min内用少量的样本进行检测，其判定的准确度高达94.42%[13]。可见质谱在外科手术、治疗干预上有一定的应用价值。现在质谱应用于小分子的结构分析在生命科学领域起着重要的作用。质谱是研究分子和混合物结构的标准技术。

乳管内液成分

乳腺疾病已成为全球女性非常常见的和致死性疾病，尽管现在乳腺疾病的死亡率呈下降趋势，但是乳腺疾病的预后和治疗的局限性都堪忧。所以，了解乳腺疾病在分子结构上的最初改变和发展至关重要。在这方面，乳管内液成分的改变正逐渐受到关注。乳管内液是乳管上皮细胞产生、分泌和重吸收的物质，其中含有多种成分，包括蛋白质(胰蛋白酶、血浆铜蓝蛋白、前白蛋白、脂蛋白等)、免疫球蛋白(IgA、IgM、IgE、IgD)、脂肪酸、激素(催乳素、雌二醇、孕酮等)、离子(Na+、K+、Ca2+等)、细胞(上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等)[14]。

离子：铝离子并不是人体组织中生理组成的一部分[15]，但铝的混合物却可以通过很多物质接触到人体，如食品添加剂、化妆品、家用家具等。而乳腺也可以接触到以铝离子为主要成分的各种各样的物质，包括饮食[16]，以及腋下使用的防汗药[17]。很多研究者测量铝离子在乳腺组织的含量，发现恶性肿瘤比邻近正常组织中铝离子的含量相对较高[18]。Mannello F等人研究得出在乳腺癌患者乳管内液中铝离子的含量较正常乳腺或良性乳腺乳管内液中铝离子的含量高(210 vs 125 μg/L)。在非乳腺癌患者中，乳管内液中铝离子的含量在绝经前后无差异；但是在乳腺癌患者中，绝经后女性乳管液中铝离子的含量较绝经前女性高[(275±33)vs(210±57)μg/L][19]。在乳腺癌患者的乳管液中除了铝离子的含量高，炎性细胞刺激因子含量也相对较高，而在非乳腺癌患者的乳管液中则相反。而炎性反应在乳腺微环境中和乳腺癌的发生和发展的危险因素相关。可见，铝离子在乳管内液中起着重要的作用。铁元素是人体健康必不可少的元素之一，在体内无论含量过多还是过少都会对健康构成威胁。Ferdinando Mannello等人研究铁在体内的平衡对乳腺微环境的影响中显示，铁蛋白和转铁蛋白在乳腺癌患者乳头抽吸液中的含量远远高于非乳腺癌患者。研究还显示，铁在体内的平衡受铝离子的调控，铁蛋白和转铁蛋白的含量与铝离子的积累有一定的相关性[20]。乳腺微环境中的Fe2+在AlO22-的作用下转化成Fe3+，增加了微环境内的氧化损伤，这种氧化应激在乳腺微环境中和乳腺癌的发生和发展的危险因素相关。可见铁离子在乳管内液中也有着重要的地位。

糖类-乳糖：乳糖存在于乳管的分泌物中被认为是乳房分泌活动的生物化学证据。Nicholas L Petrakis等人发现乳糖存在于经产妇或未生育的年轻女性的乳管液中。这一发现暗示了一些非妊娠期的妇女乳房受催乳素的刺激。因此，乳糖可以作为简单的标记来提示乳腺的生理分泌活动[21]。乳糖是乳汁中重要的营养物质，也是具有渗透性质的物质，处于泌乳期的乳腺，乳糖的渗透作用促使人体内的水分流入乳管，增加了乳汁的体积[22]。通过乳糖的渗透作用，有研究者发现乳糖按规律的饮食摄入作为可调节的因素，可以用来改变女性乳管内的分泌。这一发现有助于乳管内液作为探测乳腺疾病的诊断依据[23]。

激素：乳腺受人体体内雌性激素水平的调节，乳腺癌和雌激素水平及状态有关。许多研究学者发现伴随着女性月经周期的变化，乳管内液中的雌激素含量较血清的雌激素含量高[24～28]。这是因为乳管内的上皮细胞在芳香酶和硫酸酯酶的作用下能够合成雌激素。同时，Chatterton等人证实乳管内液中含有大量的雌激素前体物质[29]。而且，乳管内液的雌激素水平也受口服避孕药和激素替代疗法的影响。乳腺的每一个乳管的内环境是不同的。Khan等证实每一个乳管内的雌激素和雌激素前体的含量不同[30]。这也解释了为什么一个乳头会同时有不同颜色的溢液。

细胞：乳管的微环境由细胞外基质和各种基质细胞组成，细胞和细胞之间、细胞和细胞外基质之间相互作用。它们之间的相互作用影响乳腺的正常功能和异常病变。在正常的乳腺中乳管腔内的大部分上皮细胞和基质膜是不直接接触的，它们之间有一层肌上皮细胞，细胞的基质包括白细胞、纤维母细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞等。在原位导管癌的乳管中，这些肌上皮细胞显著减少，而基质的纤维母细胞、淋巴细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞随着肿瘤病变程度而增多。可见，乳管微环境的变化对乳腺是有影响的[31]。

质谱在乳头溢液中的应用

人类基因组计划在科学的探索上逐渐趋向蛋白质的研究。最初对正常和疾病的组织使用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术2D-PAGE鉴定和区分蛋白质表达。应用这种方法检测出在乳管抽吸液中有64种蛋白质，其中又有15种蛋白质在乳腺癌患者的血清或乳腺癌组织中呈现高表达。后来，Alexander等人将2D-PAGE和基质辅助激光解析电离质谱(MALDI)技术相结合，明确乳管抽吸液中与乳腺癌相关的蛋白质成分。但由于2D-PAGE技术需要大量的样本和人力，因此应用于临床存在困难。因此，用于检测蛋白质的表达其他质谱技术逐渐被发展起来，表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF)被应用，结合质谱分析分离复杂的蛋白质混合物。和以前的蛋白质分析技术相比，其最大的优点为能够提供快速的蛋白质谱。SELDI这项技术优于其他的蛋白质组学研究方法，还因为其所需的原材料最少[32]，不需要用高效液相色谱或气相色谱分离复杂的混合物。

目前SELDI-TOF技术被应用在与乳腺癌相关的乳管抽吸液中生物标识物的检测。Sauter等人从乳管抽吸液中确定了5种差异表达的蛋白质。和健康女性的乳管抽吸液相比，这5种蛋白质离子 团 (6500、 8000、 15940、 28100 和31770)频繁出现在乳腺癌患者的乳管抽吸液中[33]。除此之外，用这种质谱技术还可以进一步研究乳腺良性病变、乳管非典型增生、乳腺导管原位癌和炎症乳腺癌中蛋白质的改变，有利于乳腺癌的早期诊断。

此外，Edward等人应用SELDI-TOF证明乳管液中的β-酪蛋白肽就与乳腺癌有关。β-酪蛋白肽因此可以作为检测乳腺癌的生物标记物之一。在乳管抽吸液中有一系列的蛋白质存在，并且和乳腺癌有着密切的关系。因此，可以将乳管抽吸液中蛋白质组学作为一种非侵略性的方法来检测与乳腺癌相关的生物学标记和乳腺癌的早期诊断。

质谱除了应用于乳管抽吸液中检测蛋白组学，还可以检测小分子代谢物。代谢组学是继基因组学、蛋白质组学的另外一种研究生物代谢途径的技术。它的特点是可以描绘人体组织或液体的小分子组成。代谢物的组成标志着生物的中点，它能够反映一种疾病的遗传、表观遗传和蛋白质组学。这是因为小分子是由蛋白质产生和修饰。使用代谢组学作为肿瘤的一种标志物是对新陈代谢在肿瘤中扮演着重要角色的认识[34]。在代谢组学中，质谱是主要的技术之一。质谱分析代谢组学的复杂之处在于，在分析之前需要气相色谱或液相色谱分离样本[35]。

Gregory D等人用核磁共振(NMR)和气相色谱联合质谱(GC-MS)的方法描述乳管抽吸液[36]，他们证明了用NMR和GC-MS获得乳管抽吸液代谢谱的可行性和乳管抽吸液代谢谱不同于血液代谢谱。而且，希望通过研究乳管抽吸液的代谢物组成可以起到预防、诊断、治疗乳腺癌的作用。

综上所述，乳头溢液有别于乳头抽吸液，由于人们缺乏定期检查的意识，往往是机体出现症状时才想到检查如发现乳头有溢液后，我们可以通过收集乳头溢液，用色谱-质谱仪筛查乳腺癌，预测就诊者患乳腺癌的风险。

目前，无论是乳头抽吸液还是乳头溢液都只是在试验阶段，尚未应用到临床中。可能存在的问题：①质谱应用于乳头抽吸液或溢液的方法尚待进一步研究。②应用质谱测生物液体的蛋白组学还是代谢组学的生物标记物尚不明确。③质谱的仪器及相关仪器价格相对较贵。希望质谱可以尽早应用于临床检测，在乳腺癌的预防、诊断和治疗方面发挥作用。

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Advances in the application of mass spectrometry in nipple discharge

An Liying1,Li Yang2,Yang Bin2The Gene Diagnosis Center of No.1 Hospital of Jilin University 1300211
Department of Breast Surgery,the Third Hospital of Jilin University 1300332

Nipple Discharge is common in clinic.This article reviews the definition,the causes and the examination methods of nipple discharge.We focus on the summary of the application of mass spectrometry in nipple discharge.

Nipple discharge;Examination methods;Mass spectrometry

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.31.1