实用细胞冻存技术在自体造血干细胞移植中的应用

张璞 李晓林 薛燕 张慈现 向立丽 段雅雅 冯凯 付杰(通讯作者)

221009江苏省徐州市中心医院血液科

实用细胞冻存技术在自体造血干细胞移植中的应用

张璞 李晓林 薛燕 张慈现 向立丽 段雅雅 冯凯 付杰(通讯作者)

221009江苏省徐州市中心医院血液科

目的：分析实用细胞冻存技术在自体造血干细胞移植中的应用。方法：收集11例患者自体造血干细胞移植(AHSCT)动员的外周血造血干细胞，收集袋总容量100～150 mL，其中二甲基砜(DMSO)占总容量的10%、异体同型病毒灭活血浆占20%、外周血造血干细胞占70%。超净台无菌操作分装后放置于-20℃的冰箱冻存12 h，再置于-80℃冰箱冻存。与常用冻存技术做对照，移植前复苏干细胞，检测细胞活性、单个核细胞计数(MNC)和CD34+细胞的回收率；移植后观察患者粒细胞、血小板植入时间。结果：复苏干细胞后检测细胞活性(89.10±3.98)%，MNC和CD34+细胞的回收率分别为(91.84%±2.32)%和(90.59%±1.72)%，与对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)；移植后粒细胞中位植入时间+12 d、血小板中位植入时间+18 d，与对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。结论：DMSO与病毒灭活血浆是一种经济、易操作的干细胞冷冻保护剂。

细胞冻存；自体；造血干细胞

自体造血干细胞移植(AHSCT)因其移植相关死亡率低、无供者来源限制、无移植物抗宿主病，得到了广泛的临床应用。进行AHSCT必须对患者实施自体造血干细胞动员、采集和干细胞冻存，在目前世界上每年开展的造血干细胞移植中，超过50%是AHSCT，因此干细胞冻存技术是成功进行AHSCT的关键。

资料与方法

2015年4月-2016年12月收治AHSCT患者11例，男7例，女4例，中位年龄41岁。移植前中位化疗4个疗程。所患疾病包括恶性淋巴瘤4例，其中弥漫大B细胞淋巴瘤复发2例，急性非淋巴细胞白血病(AML)5例，急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)2例。

预处理方案、外周血造血干细胞动员和采集[1]：白血病患者采用BU/CY方案(BU 0.8 mg/kg，每6 h 1次，-7～-4 d；CY 60 mg/kg，1次/d，-4～-3 d)进行预处理。淋巴瘤患者采用BEAC方案(BCNU 300 mg/m2，-6 d；VP-16 200 mg/m2，-5～-2 d；Ara-C 200 mg/m2，-5～-2 d；CTX 1800 mg/m2，-3～-2 d)，年龄较大的患者应适当减少药物剂量。动员化疗后，待白细胞计数从最低值开始回升时给予重组人粒系集落刺激因子5～10 μg/(kg·d)皮下注射，如外周血CD34+细胞含量＞0.1%，开始使用COBESpectra(Gambro BCT公司)血细胞分离机分离干细胞，循环血量8～12 L/次，需1～2次。流式细胞仪计数CD34+细胞数，同时进行MNC，保证CD34+细胞数＞2.0×106/kg，MNC＞3.0×108/kg。

冷冻体系与复苏：自体造血干细胞采集完毕后，按采集物总量加入20%的异体同型病毒灭活血浆和10%DMSO，混匀后分装于冻存袋中，排尽空气后封口，于-20℃放置12 h，于-80℃超低温冰箱(海尔公司)低温保存，于40℃恒温水浴锅复苏后进行静脉回输，留取样本检测细胞活性、MNC和CD34+细胞的回收率。与文献报道的常用冻存技术作对照。

造血功能重建监测及随访：移植后隔天检测血常规，血小板计数(Plt)≥20×109/L，中性粒细胞计数(ANC)≥0.5×109/L，作为造血功能重建的指标，与文献报道的常用冻存技术做对照。采用电话、微信、门诊随诊等多种形式长期随访。

统计学方法：采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，结果按(x±s)、中位数表示，均数的比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

11例患者全部获得造血重建，采集自体干细胞MNC 3.13～14.0×108/kg，平均(8.21±3.71)×108/kg；CD34+2.04～18.0×106/kg，平均(4.95±4.66)×106/kg。冻存干细胞时间22.0～47.0 d，平均(29.91±7.76)d。复苏干细胞后细胞活性(89.10±3.98)%，MNC的回收率(91.84%± 2.32)%，CD34+回收率(90.59%±1.72)%，与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。自体移植后患者中性粒细胞计数(ANC)≥0.5×109/L的中位时间+12 d，血小板计数(PLT)≥20×109/L的中位时间+ 18 d，与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。输注过程中出现腹痛2例，寒战1例，减慢输注速度后缓解。

讨论

根据采集造血干细胞的方式不同，AHSCT分为自体骨髓移植和自体外周血造血干细胞移植。AHSCT移植的特点是从外周血采集造血干细胞，简单、方便、无需麻醉，不受骨髓转移或接受放疗造成损害的影响。自体外周血造血干细胞移植后的骨髓造血重建比自体骨髓移植恢复快、创伤小。目前有越来越多的医院选择从外周血采集造血干细胞。AHSCT治疗恶性血液系统疾病比传统化疗有更显著的优越性，移植后绝大多数患者无需长期化疗，延长了无病生存期，减少疾病复发，减轻了经济负担，改善了患者的生存质量[2，3]。

本研究动员方案采用强化疗后，白细胞降至最低点以形成对骨髓造血的最强刺激。此时开始给予重组人粒细胞集落刺激因子，有利于对骨髓的快速再生长形成最佳动员时机，保证采集到足够治疗数量的外周血干细胞。采集外周血造血干细胞后，体外冻存过程中保证造血干细胞的活力对移植成功至关重要。造血干细胞冻存技术的应用，可以使患者有充裕的时间选择最佳预处理方案进行造血干细胞移植，冻存质量优劣直接影响到移植成功率。造血干细胞的冷冻保存效果与冷冻保存剂的种类、浓度、降温方法、贮存和融化过程，以及储存的细胞浓度等都密切相关，选择不同的冷冻保护剂及其浓度对外周血造血干细胞的保护有显著差别[4]。传统的外周血造血干细胞冷冻保存方法是在采集外周血造血干细胞后，将装有采集完毕的外周血造血干细胞的采集袋放入冰水浴中，然后将造血干细胞低温保护剂加入采集袋中充分混匀，低温保护剂与外周血干细胞重量呈一定比例，分装到100 mL外周血造血干细胞冷冻袋中，每个袋中空气排尽后封口，放入-80℃冰箱中保存。传统冻存方法中低温保护剂在各家医院采取的成分及混合比例不尽相同，目前文献报道的主要有二甲基亚砜(DMSO)、右旋糖酐(Dextran)、白蛋白、营养素、羟乙基淀粉(HES)、自体血浆、RPMI1640等至少3种成分互相组合，DMSO所占浓度为5%或10%。相对于传统方法，我们只采用10%DMSO和异体同型病毒灭活血浆组成低温冻存液，在冷冻保护液中加入血浆既能提高保存质量，又维持了细胞在冻融过程中的活力，分装袋的数量也较以前相应减少。有报道指出10%的DMSO浓度可能较高[5]，容易引起胃肠道反应，血压增高、心律失常等不良反应，干细胞解冻后，输注过程中可能诱生凝块，导致干细胞回收率降低。对于DMSO的毒性作用，入选病例中1例72岁高龄的患者1次输注700 mL冻存体系干细胞，未发生特殊不适。对于高龄患者，适当减慢输注速度，能降低输注的不适反应，对移植后造血的恢复未产生明显影响。采用该方法冻存外周血造血干细胞，复温后细胞活性、有核细胞和CD34+细胞回收率均可达85%以上，移植患者均获得造血重建，证明了该方法有很好的安全性及有效性。

综上所述，改良新型冻存方法效果切实可靠、制作流程简单、费用低廉，完全可以满足临床中较长时间保存外周血造血干细胞的要求，促进了血液恶性疾病治疗学的发展。

[1]冯凯,许怡薇,叶扶光,等.自体外周血造血干细胞移植治疗1型糖尿病的临床观察[J].中华医学杂志,2011,91(28):1966-1969.

[2]Shi Y,Zhou S,He X,et al.Autologous hematopoietic stem cell transplantation in chemotherapy-sensitive lymphoblastic lymphoma: treatment outcome and prognostic factor analysis[J].Chin J Cancer Res,2015,27(1): 66-73.

[3]Helbig G,Krawczyk-Kulis M,Kopinska A,et al.Autologous hematopoietic stem cell transplantation for relapsed follicular lymphoma: safety profile and clinical outcome in a single-center experience[J].Med Oncol,2014,31 (12):310.

[4]Kozlowska-Skrzypczak M,Kubiak A,Bembnista E,et al.Analysis of the effect of cryoprotectant medium composition to viability of autologous hematopoietic cells collected by leukapheresis[J].Transplant Proc,2014,46 (8):2535-2538.

[5]Svalgaard JD,Haastrup EK,Reckzeh K,et al. Low-molecular-weight carbohydrate Pentaisomaltose may replace dimethyl sulfoxide as a safer cryoprotectant for cryopreservation of peripheral blood stem cells[J].Transfusion, 2016,56(5):1088-1095.

Application of practical cell cryopreservation technique in autologous hematopoietic stem cell transplantation

Zhang Pu,Li Xiaolin,Xue Yan,Zhang Cixian,Xiang Lili,Duan Yaya,Feng Kai,Fu Jie(Corresponding author)
Department of Hematology,Xuzhou City Central Hospital of Jiangsu Province 221009

Objective:To analyze the application of practical cell cryopreservation technique in autologous hematopoietic stem cell transplantation.Methods:The mobilized peripheral blood stem cells of 11 patients with autologous hematopoietic stem cell transplantation(AHSCT)were selected.The total volume of collecting bag was 100～150 mL;the two methyl sulfone(DMSO) accounted for 10%of total volume;the allogeneic virus inactivated plasma accounted for 20%;the peripheral blood stem cell accounted for 70%.They were placed-20℃refrigerator for freezer 12 hours after ultra clean aseptic operation,placed-80℃refrigerator for freezer.Compared with the commonly used cryopreservation technique,the stem cells were given recovery before transplantation,and the cell activity,mononuclear cell count(MNC)and CD34+cell percent recovery were detected.After transplantation,the granulocyte and platelet implantation time of patients were observed.Results:After recovery stem cells,the cell activity was(89.10±3.98)%;MNC and CD34+cell percent recovery were(91.84%±2.32)%and(90.59%±1.72)%;there was no significant difference that compared with the control group(P＞0.05).After transplantation,the granulocyte median implantation time was+12 d;the platelet median implantation time was+18 d;there was no significant difference that compared with the control group(P＞0.05).Conclusion:DMSO and virus inactivated plasma is an economical and easy to use stem cell cryoprotectant.

Cell cryopreservation;Autologous;Hematopoietic stem cell

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.13.31

江苏省高校自然科学研究项目(14KJB320027)

Fund ProjectJiangsu Province University Natural Science Research Project(14KJB320027)