人感染H7N9禽流感病毒核酸检测实验室生物安全管理

孙唤，刘蓉，罗美庭

湘潭县疾病预防控制中心，湖南湘潭 411228

人感染H7N9禽流感病毒核酸检测实验室生物安全管理

孙唤，刘蓉，罗美庭

湘潭县疾病预防控制中心，湖南湘潭 411228

为规范人感染H7N9禽流感病毒核酸实验室检验活动，强化生物安全管理，防止内部感染和交叉感染，该文参照《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院424号令）等有关规定，结合实际情况，从检测室布局到样品处理分析等多方面阐述人感染H7N9禽流感病毒核酸检测生物安全管理要求，以供相关人员参考。

H7N9；核酸检测；生物安全

H7N9禽流感病毒属于甲型流感病毒中的一种亚型，可引发人类急性呼吸道感染，病情进展到后期时可并发多种严重疾病，传染源尚未确切证实，可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类（该实验室从确诊病例密切接触禽类的分泌物和排泄物中检出多株H7N9阳性病毒），传播途径可能是经呼吸道、密切接触感染禽类的分泌物或排泄物等途径传播，或通过接触病毒污染的环境传播至人，不排除有限的非持续的人传人[1]。我国自从2013年3月31日在上海和安徽两地发现全球首次病例以来，内地共有19个省份累计报告H7N9病例1 000余例，死亡逾400例，病死率达高40%左右[2]。人感染H7N9禽流感危害程度大，重症患者预后差、病死率高，且病毒可能发生变异形成人际间的传播能力，其危害水平将极速增加[3]。在传染源和传播途径等诸多因素不能明确的情况下，对其生物安全管理的若干问题进行初步探讨，对强化生物安全，防范实验室内部感染和交叉感染，具有重要意义。

1 实验室生物安全管理内容

1.1 危害评估

实验室开展人感染H7N9禽流感病毒实验室核酸检测之前必须组织专业人员进行危险评估，基本内容应包括：标本中可能的致病生物因子、传播方式、感染性与致病性、对各种物理化学因子的敏感性、人体剂量反应和危害程度，以及实验室的功能定位、涉及的人员、具体操作方法和过程等。根据评估结果确定相应的防护级别。

1.2 生物安全管理综合措施

加强管理，制定并健全与之相适应的生物安全管理制度，应包括：实验室安保和准入、标准化操作规程、仪器使用和维护、实验室人员培训和考核、样本采集运输与保存、实验室消毒和医疗废弃物处理、阳性标本保存和处理、意外事故处理和报告、实验室人员健康体检等。

1.3 生物安全设施和防护

配备开展H7N9禽流感病毒核酸检测的各个功能区和主要设备，按防护要求进行个体着装，严格按照标准操作规程从事各类活动。

2 实验室生物安全级别

①H7N9禽流感病毒暂未录入《人间传染的病原微生物名录》（卫生部卫教科发[2006]15号），根据现有情况进行风险评估，疑似病例未经培养的临床样本可在二级生物安全实验室的生物安全柜内分装、灭活和核酸提取，个人防护措施也应达到相应标准。

②人感染H7N9禽流感病毒的分离培养和动物感染实验应在生物安全三级实验室进行，在此不作探讨。

3 实验室布局

人感染H7N9禽流感病毒核酸检测实验室应按《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2004）和《医疗机构临床基因扩增管理法》（卫办医政发〔2010〕194号）等要求设置。

3.1 实验室主要布局

验室分可为3个独立的工作区域（使用荧光素染色凝胶电泳进行产物检测则需分为4区，在此不做讨论），即试剂储存与准备区、样品提取区、基因扩增和分析区，每区门口贴警示标识，门可自动闭合，设有一个缓冲间，物品通过传递窗按试剂储存与准备区、样品提取区、基因扩增和分析区单一流向进行，避免各区之间交叉污染。

3.2 实验室主要设备

①试剂储存与准备区：-70℃低温冰箱、超净工作台、紫外消毒灯，混匀器。②样品提取区：生物安全柜、低温高速离心机、-70℃低温冰箱、高压灭菌器、紫外消毒灯、洗眼装置、混匀器。③基因扩增和分析区：全自动实时荧光定量PCR仪、紫外消毒灯。注：各区配有备用电源，应急照明。

4 标本采集、包装运输和保存

4.1 标本采集

H7N9禽流感病毒核酸检测主要采集患者发病早期、未服用抗病毒药物的咽拭子（还可采集深部痰液、呼吸道抽取物和支气管灌洗液等标本），操作人员必须规范操作，即要保证样本质量，还能防止病毒的传播和扩散。采样开始前做好各项准备工作，包括个人防护用品穿戴（鞋套、防护服、帽子、N95及以上水平医用防护口罩、双层医用乳胶手套、隔离衣、面罩等），防护设施和采样设备的配备等。采集咽拭子时，操作人员用压舌板轻压舌部，同时用专用采样棉签准确快速擦拭患者双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子插入装有含有3 mL采样液的管中，弃去尾部，旋紧瓶盖[4]。并对样品的种类、来源、采集方法和日期等做详细记录。样本采集完成后，将产生的医疗废物分类收集于生物废物袋，带回实验室（或在有条件的采样现场）进行高压蒸汽消毒处理。

4.2 样本包装与运输

H7N9禽流感病毒核酸检测的样品按照B类感染性物质进行包装和运输，操作人员应当经过专业知识和技能操作培训并考核通过，采用三层包装系统（由内到外分别为内层容器、中层包装和外层包装），包装和标记过程中操作人员可采用上述样品采集过程中的防护水平进行个人防护。完善相关运输申请手续，专人转车运送。

5 样本接收、保存和检测

5.1 样本接收、保存

样本交接相关工作在实验室清洁区域完成。再由专业人员穿戴个人防护装备后在样品提取区的二级生物安全柜内开启包装，检查包装状态（有异常情况应马上启动意外事故处理和报告程序），消毒内层容器表面，核对样本信息，准备实验室检测。操作过程注意动作轻柔，防止损坏内层容器，如有容器破损或内容物溢出等异常情况发生，应马上启动意外事故处理和报告程序。如样品需暂缓检测，可于2～8℃保存3 d；-20℃保存6个月；-70℃保存12个月。

5.2 样本检测和保存

操作人员必须经过专业知识和技能操作培训合格后才能上岗，进入实验室前，须穿戴好个人防护设备，包括隔离衣、防护服、N95及以上水平医用防护口罩和双层医用乳胶手套等。各功能区严格区分，物品、防护装备专用。试剂准备在试剂储存与准备区的超净工作台内进行，反应管配制完成后加盖，通过传递窗传送到样品提取区；样品处理在Ⅱ区的生物安全柜中进行，操作时动作轻缓，减少气泡产生，加样工作结束后将反应管通过传递窗送至基因扩增和分析区进行基因扩增与分析。每次实验完成后工作台及各种实验用品用10%次氯酸钠（或其他等效消毒剂）擦拭消毒，再开启紫外灯消毒处理。活动过程中产生的各种废弃物，如使用过的枪头、反应管等，高压蒸汽消毒后再运出实验室集中处置。操作和处理符合《医疗废物管理条例》相关要求。剩余样本保存在Ⅱ区的-70℃低温冰箱，详细登记相关信息，双人双锁管理。无需留存的标本视同感染性废弃物高压蒸汽消毒处理。

6 实验室安保和准入

制定实验室安保和准入制度并落实到位，禁止无关人等进入PCR实验室，培训学习等非常规状况下进入须有带教老师或实验室负责人批准，并遵守实验室相关规定。凡是进行PCR检验相关活动的工作人员必须有体检健康证明，掌握最新的生物安全防护知识和实验操作技术，了解实验潜在风险，并经培训取得相应的资格证书。在工作区域进行检验相关活动时，要自觉接受生物安全员的管理和监督。

7 仪器使用和维护

每次实验完毕后填写仪器使用相关记录并签名，包括仪器运行状况，操作内容和环境温湿度条件等；制定相关仪器维护流程与周期，定期维护，填写维护记录。当仪器出现异常不能自行处理时，报仪器厂家维修处理，维修人员必须按照二级生物安全个人防护水平穿戴，以保证其安全。

8 生物安全事故处理

实验室要制定行之有效的生物安全事故处理办法，确保储存的消毒剂足量有效，当生物安全事故发生后，当事人应马上将情况向实验室生物安全负责人如实汇报，并立刻选择相应的生物安全事故处理措施，尽量缩小意外事故的影响范围和严重程度。

人类历史上发生过许多次重大流行性疾病爆发，像鼠疫、流行性感冒、霍乱、SARS等等[5]，每次都给人类带来了巨大的生命和财产损失，因此人们开始探究有效方法，从宏观调控预防到实验室检测研究，试图多途径控制各种传染病。实验室活动早期，实验室生物安全并没有引起足够的重视，人们普遍忽视实验室感染问题，指导性文件和技术标准缺乏，实验室生物安全管理体系不健全，规章制度执行不到位，生物安全意识淡薄。2004年，某国家级病毒病研究机构的一名研究生在从事实验室活动时被SARS冠状病毒感染，并出现了第三代感染，造成了9例致病1例死亡的严重后果，引发了人们对生物安全问题高度关注，从此开启了我国实验室生物安全管理体系的建立和完善工作。

每个实验室生物安全管理体系的创建，首先要明确目标，即确保整个实验及有关活动的中人员与环境不受实验对象感染，安全处理具有传染性的物质和样品，实验室人员熟悉和掌握相关安全知识和实践操作技术。再围绕目标构建一系列框架使其得以实现，包括机构、人员、资源和体系文件等。

[1]人感染H7N9禽流感诊疗方案[Z].国家卫生计生委办公厅，2014.

[2]朱闻斐，高荣保,王大燕,等.H7亚型禽流感病毒概述[J].病毒学报,2013（3）:245-249.

[3] 曹彬.人禽流感 H7N9、H5N1、H10N8临床特征[J].生命科学,2015（5）:549-553.

[4]刘峰.临床护理实践指南[M].2011版.北京:人民军医出版社,2011.

[5]牛亚华.历史上人类与传染病的斗争[J].科学之友,2006（1）：30-36.

R7

A

1672-5654（2017）06（a）-0058-02

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.16.058

2017-03-09）

孙唤（1982-），男，湖南岳阳人，本科，主管检验师，研究方向：卫生检验。