冻融成熟卵母细胞显微受精后冻融胚胎移植成功并分娩1例及文献分析

黄 华 牛向丽 莫 毅 陈自洪 公方强

广西壮族自治区计划生育研究中心(南宁，530021)

冻融成熟卵母细胞显微受精后冻融胚胎移植成功并分娩1例及文献分析

黄 华 牛向丽*莫 毅 陈自洪 公方强

广西壮族自治区计划生育研究中心(南宁，530021)

目前精子冷冻和胚胎冷冻技术比较成熟，但卵母细胞冷冻，尤其是玻璃化冷冻仍处于应用的初级阶段。将卵母细胞冷冻技术、胚胎冷冻技术结合运用并获得成功妊娠更是困难。据检索，至今，冻融卵母细胞显微授精后冻融胚胎移植成功并分娩的病例仍鲜有报道。本文对本中心1例经玻璃化冷冻方法冷冻的成熟卵母细胞，解冻后行卵胞浆内单精子注射(ICSI)获得胚胎，再将优质胚胎行玻璃化冷冻，胚胎解冻移植后获得临床妊娠并成功分娩1正常男婴进行资料分析，为卵母细胞和胚胎多次冷冻后的临床应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般情况

患者33岁, 婚后9年，未避孕未孕7年于2015年3月6日来本研究中心的生殖中心就诊。患者性生活正常，月经规律，基础性激素检查：卵泡刺激素(FSH)11.72 mU/ml，黄体生成素(LH)16.28 mU/ml，雌二醇(E2)48 pg/ml，催乳激素(PRL)8.12 ng/ml，睾酮(T)0.59 ng/ml。B超监测自行排卵。其丈夫3次行精液常规分析，两次离心沉淀镜下见不动精子0～1条/HP。另一次未见精子，附睾穿刺亦未取得精子。经中药治疗数月后复查，离心沉淀镜检见活精子0～3条/HP，不动精子0～3条/HP。染色体核型分析为46,XY。因男方重度少弱精子症，拟行卵泡浆内单精子注射(ICSI)助孕。采用短效促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a,商品名:醋酸曲普瑞林注射液，成都天台山制药有限公司)长方案降调；用重组人促卵泡激素，FSH(果纳芬，默克雪兰诺公司,德国) 联合重组人绒毛膜促性腺激素，hCG(艾泽，默克雪兰诺公司,德国)促排卵。2015年6月10日经阴道B超引导下穿刺获取卵母细胞10枚，成熟卵母细胞(MⅡ)9枚，取卵当天男方3次取精经离心沉淀均未发现精子，患者拒绝附睾/睾丸取精。因本生殖中心无可供精的冻存精液, 患者夫妇也无接受供精的准备。征得同意后, 冻存全部成熟的MⅡ卵母细胞9枚。

1.2 卵子冻融及复苏方法

1.2.1 卵子冷冻 采用玻璃化冷冻冷冻试剂盒(KITAZATO公司，日本)，冷冻液分为平衡液 (ES)和玻璃化溶液 (VS)，使用前于室温(25℃)平衡30 min。将取卵 -胚胎处理液(G-mops-plus，Vitrolife公司，瑞典)2ml加入3001培养皿中，把已脱颗粒的成熟卵子移入，漂洗去油，在3003培养皿的皿盖配置G-mops-plus及ES微滴待用，其中G-mops-plus微滴1个，ES液滴3个(ES1、ES2、ES3)，各约20μl，G-mops-plus液滴与ES1、ES2尽量等大且成等边三角形排列。漂洗去油后的卵子首先移至G-mops-plus液滴。1 min后将G-mops-plus与ES1连线，计时2 min；2 min后在G-mops-plus与ES1连线的中点与ES2再次连线，计时2 min；最后将卵子移至ES3液滴放置5 min。同时在3003皿盖继续配置VS液滴3个，每滴约10μl。5 min后将卵子从ES3中移至VS液滴，依次进行漂洗，至最后一个VS液滴停留，准备装载，在VS液中的总时间需大于90秒，小于120秒，装载体积小于2μl，装载后迅速将载体投入液氮。

1.2.2 卵子解冻 采用玻璃化冷冻解冻试剂盒(日本KITAZATO公司)，解冻使用解冻液(TS)、稀释液 (DS)和洗液(WS-1/WS-2)。使用前，将TS于37℃平衡30 min，其他溶液于室温(25℃)平衡30 min。将卵子从液氮中取出，浸入TS中，1 min后将卵子转移至DS表面，3min后，再将卵子依次置于WS-1和WS-2中各5 min，然后将卵子转入培养液中培养。

1.3 胚胎冻融及移植方法

因为男方成熟活动精子获取极其困难(有不可预见性)，所以未同步行女方内膜准备，2015年7月30日在获得了男方的成熟活动精子后，遂将女方的冻存卵子用特殊方法进行解冻复苏，并对成熟的卵子进行了显微注射受精：解冻9枚MⅡ卵子，其中7枚存活，行ICSI共6枚MⅡ卵。授精16～18 h后观察受精情况：2PN 5枚，未受精1枚。第3天卵裂率为100%，最后，按照治疗计划，冷冻一枚D3优胚和一枚第7天囊胚。2015年9月底拟自然周期方案行内膜准备，因当月卵泡发育不佳加用尿促性素(HMG)促排卵治疗，于排卵后第3天进行冷冻胚胎复苏并在培养箱培养1天，于第4天行胚胎移植。2015年10月13日行冻融胚胎复苏移植1枚，胚胎复苏后级别为6细胞1级。本中心应用日本KITAZATO公司玻璃化冷冻复苏试剂。具体操作方法见试剂盒说明书。

2 结果

移植后用黄体酮胶囊150 mg，bid，黄体支持治疗至妊娠10周。移植后14 d查血hCG 2081 mU/ml，取得生化妊娠。移植28 d行B超监测宫内可见17mm×16mm孕囊，内见胎芽、卵黄囊及原始心血管搏动。移植42 d行B超监测宫内可见54mm×50mm×35mm孕囊，内见卵黄囊，头臀长36 mm，胎心搏动好。患者孕期无特殊情况发生，2016年6月22日孕39+6周剖宫产1男婴，体重3200g，身长49cm，Apgar评分10分，外观无异常。

3 讨论

卵母细胞冷冻保存具有重要的社会价值和现实意义。2013年美国生育年会颁布的指导原则也表明，目前成熟卵子的冷冻已不再局限于实验研究[1]。中国放开二孩政策以后，国内的卵子冷冻应用前景更加广阔。卵子冷冻技术进展较为缓慢，主要是由于人卵母细胞是体内最大的细胞，对水和冷冻保护剂的渗透性较差，细胞内的纺锤体、微管、微丝和大量的细胞质对温度高度敏感，易受到冰晶和冷冻保护剂的损伤[2]。卵母细胞内含大量水分，加之体表比例大和胞膜渗透性等特性，在低温冷冻、复温过程中容易形成冰晶，导致纺锤体受损造成细胞致命的损伤[3-4]。卵母细胞的冻存方法目前主要有程序化慢速冷冻和玻璃化冷冻。玻璃化冷冻技术从1995年开始用于人卵子的冷冻保存，因其能更好地保持卵子的生理功能，并获得更良好的妊娠结局，逐渐被广泛认可[5]。

与新鲜卵母细胞相比，玻璃化冷冻卵子的受精率、卵裂率和临床妊娠率无统计学差异[6]。秦文松等[7]回顾分析在取卵日因男方因素行卵子玻璃化冷冻的6例患者，解冻卵子后行ICSI，6例患者共解冻卵子52枚，复苏卵子31枚，复苏率59.62%。对31枚卵子行ICSI，受精21枚，受精率67.74%，形成胚胎20枚，卵裂率95.24%，5个移植周期共移植胚胎9枚，临床妊娠2例，临床妊娠率40%。耿洁等[8]报道了5 例患者取卵日实施全部冷冻保存的卵子，共复苏卵子35枚，存活24枚例，复苏率68.57%；24枚MⅡ卵子行ICSI，受精22枚，受精率91.67%；形成19枚胚胎，卵裂率86.36%，获可用有效胚胎16枚。5个移植周期移植胚胎13枚，临床妊娠2例，分娩2个健康婴儿，胚胎种植率15.38%，活产率40%。Cobo[6]、Trokoudes等[9]和Sole等[10]的研究通过用玻璃化冷冻保存的卵子供卵助孕与同期新鲜卵子助孕结局比较发现：冷冻卵子助孕获得的优胚率、种植率及妊娠率较新鲜卵子无差异。关于出生缺陷风险，在2009年Noyes等[11]分析了在过去的20多年， 289个玻璃化冷冻卵母细胞出生婴儿的资料，发现与同期自然分娩的婴儿比较，二者的出生缺陷率之间并无显著性差异。表明卵子冷冻/解冻后的妊娠以及分娩的子代没有明显增加围产期风险。因此，认为卵母细胞玻璃化冷冻是一种相对安全有效的技术[12]。

2006年，世界首例玻璃化冷冻的“三冻”婴儿在我国北京大学第三医院[13]出生。该项技术的成功标志着卵子冷冻技术难关已获得成功突破，但至今为止报道例数不多。2014年倪丰等[14]报道的1 例冻卵冻胚试管婴儿诞生。2015年徐清华等[15]报道的1例冻卵冻胚试管婴儿移植成功妊娠。多次冷冻行IVF-ET后获得妊娠出生健康婴儿的报道亦表明：随着冷冻技术的不断改良和完善，多次冷冻对卵母细胞和胚胎的损伤是有限的，卵母细胞和胚胎复苏后仍可具备较好的发育潜力，特别是如果冻融卵子在行ICSI后能形成优胚，则更有可能在多次冷冻后实现妊娠并出生健康婴儿。自2011年起本生殖中心开始进行卵母细胞玻璃化冷冻的研究，至今共进行了9例行玻璃化冷冻卵母细胞的复苏，复苏后行ICSI助孕，有3例获得妊娠(1例为左输卵管妊娠，2例活产分娩)，婴儿随访未见异常。本例采用玻璃化冷冻卵子复苏率为77.8%，受精率为88.3%，卵裂率为100%，达到与新鲜卵子一致的效果。本例冻卵、冻胚试管婴儿成功诞生，为卵母细胞及胚胎多次冷冻的临床应用提供一定的积累和参考。

[1] Practice Committees of American Society for Reproductive Medicine. Society for Assisted Reproductive Technology. Mature oocyte cryopreservation: a guideline[J]. Fertil Steril, 2013, 99(1):37-43.

[2] 李媛. 人类辅助生殖实验技术[M]. 第1版. 北京：科学出版社, 2008:170-182.

[3] Shaw JM, Oranratnachai A, Trounson AO. Fundamental cryobiology of mammalian oocytes and ovarian tissue [J]. Theriogenology, 2000, 53(1):59-72.

[4] Baka SG, Toth TL, Veeck LL, et al. Evaluat ion of the spindle apparatus of in-vitro matured human oocytes following cryopreservation[J]. Hum Reprod, 1995, 10(7):1816-1820.

[5] Nagy ZP, Chang CC, Shapiro DB, et al．Clinical evaluation of the efficacy of an oocyte donation program using egg cryo-banking[J]．Fertil Steril, 2009, 8, 92(2):520-526．

[6] Cobo A, Diaz C. Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J]. Fertil Steril, 2011, 96(2):277-285.

[7] 秦文松，刘英，秦辉灵，等. 人卵母细胞玻璃化冷冻技术在辅助生殖中的应用[J]. 中国性科学，2015, 2:93-95.

[8] 耿洁，胡玉琴，刘兰兰. 卵子玻璃化冷冻在体外受精-胚胎移植取精失败周期中的应用[J]. 实用医院临床杂志，2014, 1:156-157.

[9] Trokoudes KM, Pavlides C, Zhang X.Comparison outcome of fresh and vitrified donoroocytes in an egg-sharing donation program[J]. Fertil Steril， 2011, 95(6):1996-2000.

[10] Sole M, Santalo J, Boada M, et al.How does vitrification affect oocyte viability in oocyte donation cycles? A prospective study to compare outcomes achieved with fresh versus vitrified sibling oocytes[J]. Hum Reprod，2013,28(8):2087-2092.

[11] Noyes N, Porcu E, Borini A. Over 900 oocytecryo preservation babies born with no apparent increase in congenital anomalies[J].Reprod Biomed Online，2009;18(6):769-776.

[12] Zhang L, Yan LY, Zhi X, et al. Female fertility: is it safe to "freeze?"[J]. Chin Med J (Engl), 2015, 128(3):390-397.

[13] 陈贵安, 蔡学泳, 廉颖, 等. 玻璃化冷冻成熟卵母细胞经解冻精液单精子注射受精并胚胎冻融及移植妊娠成功[J]. 中华妇产科杂志, 2006, 4(41):217-218.

[14] 倪丰, 汪存利, 姜宏, 等. 冻融卵母细胞显微授精后冻融胚胎移植成功并分娩一例报道[J]. 生殖医学杂志, 2014, 23(8):676-678.

[15] 徐清华, 张 敏, 常秀峰, 等. 冻融卵母细胞显微受精后冻融胚胎移植成功妊娠一例[J]. 解放军医药杂志, 2015, 5(27):21-22.

[责任编辑：王丽娜]

广西壮族自治区计划生育委员会科研项目(桂人口计生研1109，桂人口计生研1102)；广西壮族自治区卫生和计划生育委员会科研课题(Z2016374)；广西自然科学基金项目(2014GXNSFBA118199)

2016-08-16

2016-12-23

*通信作者： 59075287@qq.com