低聚半乳糖的研究进展

孙纯，祝文兴，刘新利

(齐鲁工业大学 生物工程学院，济南 250353)

低聚半乳糖的研究进展

孙纯，祝文兴，刘新利*

(齐鲁工业大学 生物工程学院，济南 250353)

低聚半乳糖(GOS)是一种具有天然属性的功能性低聚糖，因其具有的理化性质及生理功能独特，在食品、调味品、保健品、医药等领域应用广泛，市场前景非常广阔。文章综述了低聚半乳糖的生产工艺、分离纯化方法以及应用，最后对高纯度的GOS的制备工艺进行了展望。

低聚半乳糖(GOS)；功能性低聚糖；生产工艺；分离纯化；应用进展

低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)是一种新型的功能性物质，是具有天然属性的功能性低聚糖的一种，而且是母乳中的一种重要益生元[1]。在乳液中含量较高，其适口性、水溶性和稳定性都较好，而且其进入人体后可以使人体肠道中的益生菌尤其是双歧杆菌增殖，同时也能抑制腐败菌的生长。低聚半乳糖在调味品行业应用广泛，由于其特殊的理化性质和功能，被广泛添加到饮料、乳制品和烘焙食品中，既能调节食物的风味，又能起到营养益生的作用。肠道中的益生菌利用低聚半乳糖增殖的同时还能产生大量胞外多糖。胞外多糖不仅有抗肿瘤活性、免疫活性，还能促进益生菌在肠道内长期定植。从而具有降低血清中总胆固醇浓度、改善体内脂质代谢和促进矿物质吸收等各种功效，对阿尔兹海默病、糖尿病、帕金森氏病、抑郁症和肥胖等疾病，都有预防和治疗的作用。由于低聚半乳糖拥有的功能性，其成为现代开发应用的研究热点。本文主要从低聚半乳糖的制备工艺、分离纯化及应用现状方面进行了整理综述，并展望了其重点的研究方向，为GOS的大量广泛应用提供支持。

1 生产技术方面的进展

GOS的制备方法有5种：(1)自然提取法：从自然界物质中提取低聚半乳糖的成本高、产量少且分离困难；(2)酸水解多糖法：转化率低，提纯困难；(3)化学合成法：毒性大，污染严重；(4)发酵法：工艺研究少，分离提纯困难；(5)酶法合成：成本相对较低，是目前应用最广的制备方法[2]。酶法合成的基本生产原理是用乳糖为主要原料，通过利用β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)进行转糖苷作用来获得。但是近几年来，人们通过研究优化生产途径的各个环节，比如β-半乳糖苷酶的固定化研究，得到了更多更高效的生产途径来生产低聚半乳糖。

1.1 产酶菌种的选育

β-半乳糖苷酶是生产低聚半乳糖的关键酶，其主要来源于自然界中的动物(乳汁)、植物(苹果等)和微生物(酵母、霉菌等)。工业生产中的β-半乳糖苷酶大部分从微生物中提取。菌种选育成为工程研究的热点。

王欣等[3]在2015年用人工底物邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)为筛选标记，从耐有机溶剂微生物菌库中，筛选出具有较高水解活性的β-半乳糖苷酶产生菌，再以乳糖为底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能，筛选得到1株产β-半乳糖苷酶的Erwinia billingiae WX1。根据GenBank 中相同属种的基因组序列推测β-半乳糖苷酶基因，克隆得到β-半乳糖苷酶基因gal，同时在大肠杆菌中实现了β-半乳糖苷酶的克隆表达。2016年李美玲等[4]通过对环状芽孢杆菌B.circulansSK28.003的发酵获得 β-半乳糖苷酶酶液，经过浓缩、盐析沉淀和低温冷冻干燥，制备酶粉。 利用β-半乳糖苷酶的转糖苷功能催化乳糖合成低聚半乳糖，采用单因素和正交试验优化，通过高效液相色谱法检测，以GOS产率为评价指标，确定最佳合成条件：乳糖起始质量浓度为50 g/dL，加酶量为6 U/g，反应温度为60 ℃，pH为7.5。在此条件下反应12 h，GOS产率可达45.5%。

1.2 β-半乳糖苷酶的固定化

固定化酶因为具有重复利用率高、热稳定性好等优点，被广泛研究利用。近年来，有关β-半乳糖苷酶的固定化研究也时有报道。

2014年张丰华等[5]对β-半乳糖苷酶固定化材料进行比较研究，得出氨基载体固定化酶的热稳定性明显高于游离酶及环氧基载体固定化酶；在其重复使用20次后，酶的活力仍保持在60%以上。以300 g/L的乳糖为起始浓度,利用该氨基载体固定化酶生产低聚半乳糖,得到的最大产量为87 g/L。2015年费俊杰研究得出以离子交换树脂I002为载体,通过先吸附后交联的方法固定β-半乳糖苷酶，加酶量为51.8 U(以1 g树脂计),pH为6.5,温度为25 ℃,吸附时间为12 h,戊二醛体积分数是4%,交联温度是40 ℃,时间是6 h时,固定化效果最好。获得的固定化酶活可达16.2 U，固定酶回收率为39.1%,得到低聚半乳糖(GOS)的产率为24.2%。2016年刘鑫龙等[6]研究了以壳聚糖吸附与戊二醛交联固定化的半乳糖苷酶为催化剂，来合成低聚半乳糖的过程，并对其反应条件进行了优化。实验结果表明：最佳的反应条件为以质量浓度50%的乳糖为底物，溶液pH值为6.5，反应温度是40 ℃，向体系中加入2 mmol/L的Mg2+，640 g/L的酶用量，反应4 h后，低聚半乳糖的产率为71.5%。在重复使用7次后，催化得到的GOS产率仍为64.9%，展现了良好的稳定性。

1.3 生产工艺条件优化

在工业化生产低聚半乳糖成为一个研究热点后，有大量研究人员对低聚半乳糖生产过程中的一些工艺条件进行了充分的优化，使低聚半乳糖的生产工艺更加高效和低成本。

2015年刑肖肖等[7]对生产工艺进行优化得出制备低聚半乳糖的最佳工艺条件为37 ℃、pH 8.0，K+0.08 mol/L、初始乳糖质量浓度500 g/L、反应时间5 h、加酶量10 μL/g乳糖，在此条件下低聚半乳糖的生成质量浓度达到94.74 g/L。2016年付文佳等[8]又得出β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的最佳反应条件为底物(乳糖)浓度50%、加酶量40 U/g、pH 7.5、50 ℃，在以上条件下反应2 h，低聚半乳糖产率为23.4%。

1.4 新型生产技术的研发

部分研究员不局限于现在已有的生产技术，通过大量调研和实验得出了一些新型的生产工艺，为低聚半乳糖的规模化工业生产提供了更多的选择。

2016年浙江工业大学魏春等[9]以乳糖为底物，利用含β-半乳糖苷酶的植物乳杆菌透性化细胞催化生产低聚半乳糖。在5 L的发酵罐中进行了厌氧发酵，将收获的植物乳杆菌菌体全部用于透性化全细胞催化生产GOS的研究。得到在乳糖质量浓度为400 g/L，初始pH为7.0，温度为50 ℃及反应进行10 h的条件下，GOS产量达到最大值32%(质量分数)。专利CN200810157830.X研发出了一种用重组酿酒酵母来生产低聚半乳糖的工艺，首先构建出β-半乳糖苷酶酵母的表面展示载体，然后将β-半乳糖苷酶展示在酿酒酵母的细胞表面，最后循环利用该重组酵母来发酵乳糖从而生产低聚半乳糖[10]。

2 纯化分离技术的进展

通过酶法生产的低聚半乳糖成分复杂，其中含有许多没有被酶催化反应的葡萄糖、乳糖等非有效成分。这样造成所生产的低聚半乳糖纯度不高，降低了它的功能，使其利用率低。因此，需要通过一些手段将其纯化分离，从而扩大它的应用范围[11]。现在已有的分离纯化手段主要是色谱柱分离法、膜分离法、生物法和酶法等[12]。

2.1 色谱柱分离法

色谱柱分离法的原理是待分离物各组分对固定相和流动相间的结合力不同，从而达到分离效果。结合力强的流出得慢，结合力弱的流出得快。色谱柱分离法的优点是可以连续循环操作，吸附剂可以重复使用，但是这种方式分离效率较低，且前期操作复杂[13]。2009年冯咏梅等[14]用葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25对低聚半乳糖粗品进行了纯化分离，实验得出：利用此凝胶柱一次上柱可以使GOS纯度达到85.03%，经过二次上柱后，GOS纯度可达到89.39%。

2.2 膜分离法

膜分离法的基本原理是通过膜的孔径控制分子的流出，分子大的被滞留膜内，分子小的流出，由此达到分离纯化的目的。优点是分离效果好，不影响酶的活性。缺点是膜容易受到污染而且分子量相近的物质难以分离[15]。Goulas A K等[16]将低聚半乳糖混合物先后通过NF-CA-50(25 ℃)和DS-5-DL(60 ℃)膜，GOS纯度可达98%。Feng Y M等[17]用NF-3膜(截留相对分子质量800～1000 u的物质)对低聚半乳糖粗品进行纯化分离，GOS纯度提高了大约1.5倍。

2.3 生物法和酶法

生物法是利用微生物发酵的方式去除掉混合物中的杂糖，比如利用酵母和乳酸菌就可以去除葡萄糖、乳糖[18]。缺点是操作耗时较长且操作复杂，并会带入其他物质，难以去除[19]。酶法是加入各种专一酶，通过酶分解去除相应杂糖。其缺点更加明显，酶成本很高且加入量难以确定，而且随着酶解反应的发生，体系的pH会降低，从而影响酶的活性[20]，分离效果差[21]。生物法和酶法应用较少，近年来对这两种方法的报道也较少出现。

2.4 新型纯化技术

2016年李良玉等[22]采用低聚半乳糖粗品为原料，用自制的模拟移动色谱(SMB)和顺序式模拟移动色谱(SSMB)设备分别纯化原料。最佳技术参数：进料折光60%，柱温60 ℃，进料量467 mL/h，进水量722.4 mL/h。在此条件下低聚半乳糖的纯度为95.1%。

3 应用方面的进展

随着科学的不断发展，人们对物质进行不断研究和开发，使得食品中一些有益成分被报道出来并大量生产供人们生活需要，满足了人们的营养需求。其中就包括存在于母乳中的低聚半乳糖，据研究表明低聚半乳糖可以促进肠黏膜修复[23]，促进肠道内双歧杆菌等有益菌的生长定殖，提高人体免疫力[24]，促进婴幼儿生长发育[25，26]，降低胆固醇及抑制骨质疏松[27]等各种功能。因为低聚半乳糖具有的这些功能，使其对一些疾病都有一定的预防和治疗作用，比如肥胖症、阿尔兹海默病、糖尿病、帕金森氏病、抑郁症等，近年来也有很多相关的报道。因此，低聚半乳糖在食品、保健品、药品方面都有较大应用。

3.1 食品方面的应用

由于低聚半乳糖的理化性质及生理功能特殊，被广泛应用于调味品行业，比如饮料、糖果、烘焙食品、果酱、奶粉以及宠物食品等方面。在乳制品中添加GOS是因为其溶解性好，而且被称为是双歧杆菌的生长因子，使生产出的奶粉等与母乳更加相似，保证喂食奶粉的婴幼儿肠道菌群环境和食用母乳的婴幼儿肠道菌群环境相同，从而促进婴幼儿的生长发育。而且还能解决部分患有乳糖不耐症的人的营养需求。将其添加到饮料中也是因为其溶解度高、稳定性好、适口性好、低致龋齿性并且GOS的功能性也不会遭到破坏。将它添加到酸奶中还有一个重要因素是GOS不会被乳酸菌破坏掉，仍能发挥它的功能。在烘焙食品中添加GOS是因为其耐热性和稳定性都很好，不会在高温烘焙的情况下受到破坏。低聚半乳糖在调味品行业的广泛应用，促进了整个功能性多糖行业的发展。

3.2 保健品方面的应用

随着人们生活水平的提高和知识的增长，人们越来越不满足于仅从食物中来获取营养因子。所以保健品的出现满足了人们的需求，保健品是某种或多种营养因子的聚合体。它纯度高，含量大，仅吃一片就能满足一整天的需求量，正是由于这些特点，所以被人们广泛使用。由于GOS具有的功能性较多，被称为功能性低聚糖的一种，被广泛生产成各种保健品，用于增强人的免疫力等。

3.3 药学方面的应用

GOS具有的生理功能对一些疾病都有预防和治疗作用，因此在医药方面也有应用。低聚半乳糖可被肠道中的有益菌利用，同时再利用碳水化合物产生一些短链脂肪酸，通过抑制肝中的胆固醇合成从而使血清中的胆固醇重新分布到肝脏中，因此起到降低胆固醇的作用。2015年辛跃强等[28]研究发现低聚半乳糖能促进植物乳杆菌和双歧杆菌产生更多胞外多糖，胞外多糖不仅有抗肿瘤活性、免疫活性，还能促进益生菌在肠道内长期定植。由于很多国外报道肠道菌群环境的改变可能导致很多疾病的发生，比如阿尔兹海默病、帕金森氏病、抑郁症、肥胖症等，因此能调节肠道菌群的低聚半乳糖越来越受到关注[29，30]。

4 结语与展望

正常人体的肠道中定殖着种类数千、数量十分庞大的一个机构复杂的菌群集体，它们的工作井然有序。其对人体具有多种作用，比如免疫、营养和生物拮抗等。近年来，由于滥用抗生素、人们精神压力过大和环境变化等原因，导致肠道菌群失衡，成为影响公众健康的头号威胁。多年来，诸多报道已证实肠道菌群的变化与人体健康息息相关。帕金森氏病、抑郁症、阿尔兹海默病和糖尿病等疾病的发生都与肠道菌群的变化直接相关。低聚半乳糖在调味品行业的广泛应用，既能达到食品的营养性和口感，又是低聚半乳糖发展的重要方向。在调味品方面的应用还需要进行大量研究，通过在食物中添加低聚半乳糖来达到预防和治疗一些疾病，是人们更愿意接受的方式。因此为了解决这些问题，应该大力提高我国低聚半乳糖产品的市场占有率，生产出更高质量、更低成本的GOS是我们目前急需解决的重要课题。虽然已有很多研究得到较好的生产工艺，但是采用现代生物技术提高生产工艺水平仍是我们进一步研究开发的关键问题。

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ResearchProgressonGalactooligosaccharides

SUN Chun，ZHU Wen-xing，LIU Xin-li*

(College of Biological Engineering, Qilu University of Technology, Ji'nan 250353, China)

As a kind of natural attributed functional oligosaccharide, galactooligosaccharides (GOS) have unique physical and chemical properties and physiological functions, and they are widely applied in food,condiment,health-care products, medicine and other fields, which has broad market prospect.The preparation process,separation and purification methods of GOS and application progress are summarized. Finally, the preparation process of high-purity GOS is prospected.

galactooligosaccharides(GOS);functional oligosaccharide;production process;separation and purification;application progress

TS201.4

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.038

1000-9973(2017)11-0170-05

2017-05-27 *通讯作者

国家自然科学基金资助项目(21272139)；国家高技术研究发展计划(863)(2006AA09Z415)；山东省科技发展计划(2012GSF12107)

孙纯(1991-)，女，硕士，研究方向：生物制药；

刘新利(1971-)，男，教授，博士，研究方向：微生物。