大黄酸通过抑制miR-21而干预TGF-β1/Smad通路并减轻博莱霉素所致大鼠肺纤维化*

屈 艳， 张 崇， 贾岩龙， 宋 宇， 牛秉轩， 詹合琴

(新乡医学院 1基础医学院， 2药学院， 河南 新乡 453003)



大黄酸通过抑制miR-21而干预TGF-β1/Smad通路并减轻博莱霉素所致大鼠肺纤维化*

屈 艳1， 张 崇2△， 贾岩龙2， 宋 宇2， 牛秉轩2， 詹合琴2

(新乡医学院1基础医学院，2药学院， 河南 新乡 453003)

目的： 观察大黄酸(rhein，RH)对博莱霉素所致肺纤维化大鼠微小RNA-21(miR-21)表达以及转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad通路的影响。方法: 博莱霉素一次性气管内注射复制大鼠肺纤维化模型，随机分为RH低、中、高剂量组及模型(model)组；正常对照组大鼠气管内注射生理盐水。用药28 d后，HE染色观察各组大鼠肺组织形态学的变化；测定肺系数、肺组织羟脯氨酸含量；real-time PCR检测肺组织中miR-21和TGF-β1/Smad7 mRNA表达；Western blot法分析TGF-β1和Smad7 蛋白的表达。结果: 与model组相比，RH用药组大鼠的肺泡炎及肺纤维化程度有明显降低，肺系数及肺组织羟脯氨酸含量也显著减少，肺组织中miR-21表达下降，TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平也明显下降，Smad7的mRNA及蛋白表达水平明显增高(P<0.05)。结论: RH抗肺纤维化的作用可能与抑制miR-21的表达，从而干预TGF-β1/Smad信号通路，减少细胞外基质沉积有关。

大黄酸； 肺纤维化； 微小RNA-21； 转化生长因子β1； Smad7

大黄酸(rhein，RH)是一种天然的蒽醌衍生物，可以从蓼科植物，如大黄、虎杖、何首乌等多种中药中分离提纯得到，应用历史达千年以上，近些年研究表明RH还可发挥抗肿瘤[1-2]、抗菌[3]、抗炎[4]、抗病毒[5]等多种药理作用。目前发现RH还可以干预多种器官组织的纤维化过程，例如肾脏纤维化[6]、胰腺纤维化[7]以及肝脏纤维化[8]均有研究，而在肺纤维中的具体作用尚不清楚。器官纤维化病理过程大都是纤维组织增生，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积所致，RH能否在肺纤维化中也能起到作用，国内外未见报道，因此本研究拟采用博莱霉素复制肺纤维化大鼠模型，观察RH的抗肺纤维化作用，并进一步探讨其作用机制。

材 料 和 方 法

1 动物

雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，由河南省实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK(豫)2010-0002。

2 主要药品和试剂

注射用盐酸博莱霉素A5(Nippon Kayaku)；羟脯氨酸测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；RH(纯度≥98%)(南京泽朗医药有限公司)，使用前用0.5%羧甲基纤维素钠配制成不同浓度的混悬液；抗TGF-β1 单克隆抗体(Abcam)；抗Smad7 多克隆抗体(Santa Cruz)；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(TaKaRa)；All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit(GeneCopoeia)。PCR引物由Invitrogen合成；实时荧光定量PCR检测系统为Thermo Fisher Scientific产品。

3 主要方法

3.1 肺纤维化模型的制备、分组及给药 大鼠麻醉后，钝性分离暴露气管，经气管软骨环间隙向心端穿刺，一次性气管内滴入博莱霉素生理盐水溶液0.2～0.3 mL(5 mg/kg)复制肺纤维化模型，正常对照(control)组以相同方法滴入等体积生理盐水，立即将动物直立并行旋转使药物分布均匀。造模后当日将动物随机分成模型(model)组及RH-低(low, L)、中(medium, M)、高(high, H)剂量组，低、中、高剂量分别为25、50、100 mg/kg，每日上午采用灌胃方法进行给药，给药剂量的选择主要参考了文献[4, 7]，并通过预实验确定，control组和model组以同样方法给予等容量0.5 %羧甲基纤维素钠溶液。给药28 d后，股动脉放血处死所有动物，收集待测标本

3.2 肺系数的检测 处死大鼠后，完整分离出气管和双肺，吸干肺脏表面水分，称量肺湿重，计算肺系数 [肺系数=肺湿重(mg)/大鼠体重(g)]

3.3 肺组织羟脯氨酸含量的测定 取右肺中叶组织，称重后剪碎、匀浆，测定方法按碱水解法羟脯氨酸试剂盒说明进行。

3.4 病理组织学的观察 取左肺，使用4%多聚甲醛先经左主支气管灌注固定30 min后完全投入4%多聚甲醛中继续固定24 h，常规石蜡包埋切片、行HE染色，根据Szapiel等[9]提供的方法评价肺泡炎及纤维化程度，2种病变程度均分为4级：0级无明显病理改变，肺泡结构正常者评0分；1级轻度改变，病变范围小于全肺的20%者评1分；2级中度改变，病变范围占全肺的20%～50%者评2分；3级重度改变，病变范围占全肺的50%以上者评3分。

3.5 Real-time PCR检测各组肺组织中miR-21的表达及TGF-β1/Smad7的mRNA水平 用TRIzol提取总RNA，反转录为cDNA后进行real-time PCR反应，GAPDH作为内参照，上游引物序列为5’-CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC’， 下游引物序列为5’-TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT-3’； TGF-β1的上游引物序列为5’- AGCGGACTACTATGCTAAAGAGGTCACCC-3’， 下游引物序列为5’-CCAAGGTAACGCCAGGATTGTTGCTATA-3’； Smad7的上游引物序列为5’-TTTTGAGGTGTGGTGGG-3’，下游引物序列为5’-GAGGCAGTAAGACAGGGATGA-3’。反应体系(10 μL)包括SYBR Premix Ex TaqTMⅡ buffer 5 μL，上、下游引物各0.2 μL， cDNA模板0.2 μL，ddH2O 4.4 μL。反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。miRNA检测采用miRNA 逆转录试剂转录为cDNA后，All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit进行real-time PCR反应，U6作为内参照，其引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；miR-21引物为：5’-CGGCTAGCTTATCAGACTGA-3’。反应体系20 μL，包括qPCR Mix 10 μL、miRNA qPCR Primer 2 μL、Universal Adaptor PCR Primer 2 μL、cDNA模板2 μL、ROX reference dye 0.4 μL、ddH2O 3.6 μL。反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，45个循环；60～95 ℃熔解曲线分析，每个样品重复3次。数据的收集和分析由PikoReal Software 2.0完成，研究采用2-ΔΔCt法计算目标mRNA的含量。

3.6 Western blot法检测TGF-β1和Smad7 蛋白的表达 用RIPA裂解约100 mg肺组织，提取裂解上清液，BCA法测蛋白浓度，采用SDS-PAGE分离蛋白，转膜，封闭，分别 加相应的I 抗4 ℃孵育过夜后，加辣根过氧化物酶标记 II 抗孵育2 h，ECL检测试剂盒显影，凝胶成像系统照相，ImageJ 1.43软件分析灰度值，对各组蛋白表达差异进行分析。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件，等级资料比较用秩和检验，多组总体比较采用Kruska-WallisH检验分析，组间两两比较采用Mann-WhitneyU检验进行统计学处理；计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，多组总体比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验进行统计学处理，以P<0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 肺组织的病理组织学观察

HE染色结果显示，control组肺组织结构正常，偶见炎性细胞，无间质纤维组织增生；model组的肺组织结构紊乱，大量肺泡壁断裂，肺泡腔塌陷，肺泡间隔显著增宽，有大量纤维组织增生及胶原沉积，炎性细胞浸润，多呈3级纤维化和2级肺泡炎改变，与control组相比，肺泡炎及肺纤维化评分显著提高(P<0．01)；RH给药组多数肺组织结构较为清晰，肺泡间隔增宽不明显，胶原组织增生降低，多呈1级纤维化改变，炎性细胞浸润减少，评分均较model组明显减轻(P<0．05)，结果见图1、表1。

Figure 1. The effect of rhein on the pathological changes of pulmonary tissues in the rats with pulmonary fibrosis (HE staining, ×100).

图1 RH对肺纤维化大鼠肺组织病理形态学的影响

表1 RH对大鼠肺泡炎及肺纤维化的影响

**P<0．01vscontrol group;△P<0．05,△△P<0．01vsmodel group.

2 RH对大鼠肺系数及肺组织羟脯氨酸含量的影响

与control组相比，model组大鼠肺系数及羟脯氨酸含量明显增高(P<0．01)，RH给药组肺系数及羟脯氨酸含量有显著降低(P<0．05)，见表2。

3 RH对miR-21水平及TGF-β1/Smad7 mRNA相对表达量的影响

Real-time PCR检测后的熔解曲线显示，各基因扩增产物均为单峰，无非特异性产物或引物二聚体出现。Model组的miR-21水平和TGF-β1 mRNA的相对表达量均较control组有明显增高(P<0．01)，而给予RH后，两者的表达水平明显降低；Smad7 mRNA在model组中表达下降，在RH-M和RH-H组则明显升高(P<0．01)，见表3。

4 RH对TGF-β1和Smad7 蛋白表达的影响

与control组相比，model组大鼠TGF-β1蛋白的表达水平明显升高，而RH给药后TGF-β1蛋白明显下降(P<0．05)， Smad7的蛋白表达量则相反，model组表达明显降低，而给药后能够提高其表达水平，与mRNA的表达结果一致，见图2。

表2 RH对大鼠肺系数及羟脯氨酸含量的影响

Table 2.The effecs of rhein on lung coefficient and hydroxyproline in rats (Mean±SD.n=10)

GroupDose(mg/kg)Lungcoefficient(mg/g)Hydroxyproline(mg/g)Control—4．65±0．580．75±0．09Model—8．24±1．18∗∗1．06±0．10∗∗RH⁃L257．14±0．65△0．94±0．12△RH⁃M506．75±0．69△△0．85±0．08△△RH⁃H1006．17±0．78△△0．81±0．09△△

**P<0．01vscontrol group;△P<0．05,△△P<0．01vsmo-del group.

讨 论

目前，肺纤维化的发病机理仍然不清楚，尚无有效的治疗方法[9]，主要病理基础为成纤维细胞过度增殖， ECM沉积所致，胶原蛋白是ECM的主要成分，而羟脯氨酸是胶原蛋白中一种特有的氨基酸，当胶原蛋白代谢发生异常时，组织内羟脯氨酸含量会发生相应的变化，因此测定肺组织羟脯氨酸含量，可以反映肺组织中胶原蛋白即ECM的含量，RH用药后，羟脯氨酸含量有明显降低，提示RH可以减少ECM的合成。在肺纤维化形成过程中，由于肺泡壁纤维结缔组织增生和胶原蛋白的沉积，及大量炎性细胞浸润等因素能使肺纤维化大鼠的肺重量增加，因此肺系数可间接反映肺组织纤维化的程度，RH可以降低肺系数，同时，从组织病理学观察也发现，RH抑制了肺泡炎及肺纤维化的程度，也印证了其抗肺纤维化作用。

表3 RH对miR-21、TGF-β1/Smad7 mRNA表达的影响

**P<0．01vscontrol group;△P<0．05,△△P<0．01vsmodel group.

Figure 2.The effect of rhein on the protein expression of TGF-β1 and Smad7. Mean±SD.n=10.**P<0．01vscontrol group;△△P<0．01vsmodel group.

图2 RH对TGF-β1和Smad7 蛋白表达的影响

TGF-β1是促进肺纤维化的重要因子，TGF-β/Smad信号通路在其中具有重要的调控作用[10]，可促进胶原蛋白等ECM过度沉积，而导致肺纤维化的产生[11]。本研究也表明model组大鼠TGF-β1增高明显，而RH能使其mRNA及蛋白表达水平明显下降，He等[12]发现RH能够抑制TGF-β的表达而发挥抑制肾间质纤维化作用，与本研究结果相似。另外，有研究表明Smad7 在TGF-β/Smad信号通路中起非常重要的调节作用，它可沉默整个信号通路，从而抑制TGF-β的作用[13]。Smad7 能与细胞膜上TGF-β受体竞争性结合，阻断TGF-β信号在胞浆内的传导，下游信号紊乱，在TGF-β信号中通路中起负性调节作用，是TGF-β信号转导通路失活的机制之一[14]，而超表达Smad7 能够使过度激活的TGF-β/ Smad信号通路平衡恢复，发挥抗纤维化作用[15]。本研究也发现RH能提高Smad7 表达水平，证明RH能抑制促纤维化细胞因子TGF-β1表达，并通过上调Smad7，干扰TGF-β/smad信号通路，减少ECM的沉积。

MicroRNA参与基因的表达调控，导致mRNA的降解或翻译抑制，近些年发现在多种病理生理学过程中发挥重要作用[16]。约10%的miRNA在肺纤维化过程中有明显改变，其中被证实起重要作用有Let-7、miR-21、miR-29、miR-154等[17]，这些MicroRNA可能成为肺纤维化发生发展的关键因子及药物作用的新靶点。miR-21是miRNA转录的主要驱动子，在肿瘤、心血管疾病等许多病理过程中表达上调[18]。Liu等[19]研究证明miR-21在博莱霉素诱导的肺纤维化model中和特发性肺纤维化病人中，均呈高表达状态，TGF-β1能增强miR-21的表达，反过来miR-21又能上调TGF-β1功能，促进其诱导肺纤维作用。本研究发现miR-21在肺纤维化model组中表达明显增高，与TGF-β1高表达同步，与前人研究相一致，证明miR-21与TGF-β1确实可能具有密切的联系，并可能在肺纤维化发生发展过程中存在协同作用。另有研究认为TGF-β是通过Smad途径促进miR-21表达，miR-21能够抑制Smad-7表达，增加TGF-β促肝纤维化作用[20]，同样肾纤维化中也有研究发现在TGF-β1能上调miR-21的表达，并成剂量及时间依赖性，采用siRNA方法沉默Smad7 能直接调节α-SMA和E-cadherin 表达，miR-21表达增强后可通过抑制靶基因Smad7 表达，增强TGF-β1导致ECM沉积而导致的纤维化作用[21]，因此过表达miR-21，Smad-7表达下调，通过Smad信号通路可增强 TGF-β1诱导ECM过量沉积。在TGF-β1介导的肺纤维化中，针对miR-21进行抑制可能是一个更好的选择。本研究发现使用RH后，miR-21的表达受到了明显的抑制，同时TGF-β1表达也同步降低，而Smad7 表达水平却增加，ECM沉积被抑制，推测RH发挥抗肺纤维化作用可能与其抑制miR-21的表达，使Smad7 的表达增强，从而干预TGF-β1/Smad信号通路，减少了ECM沉积有关。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Rhein attenuates bleomycin-induced rats pulmonary fibrosis through TGF-β1/Smad pathway by inhibiting miR-21 expression

QU Yan1, ZHANG Chong2, JIA Yan-long2, SONG Yu2, NIU Bing-xuan2, ZHAN He-qin2

(1SchoolofBasicMedicine,2CollegeofPharmacy,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China.E-mail:chong29@126.com)

AIM: To investigate the effect of rhein on bleomycin-induced pulmonary fibrosis and the expression of microRNA-21 (miR-21) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1)/Smad signaling molecules in rats. METHODS: A single dose of bleomycin was intratracheal injected into the SD rats to induce pulmonary fibrosis. After injection of bleomycin, the rats were randomly divided into low-, medium- and high-dose rhein treatment groups and model group. The rats that were instilled with normal saline intratracheally served as control group. After the treatment for 28 d, the pulmonary pathologic changes were observed under microscope with hematoxylin-eosin staining. The lung coefficient and hydroxyproline content were also measured. The expression of miR-21 and the mRNA levels of TGF-β1 and Smad7 in the lung tissues were detected by real-time PCR. The protein levels of TGF-β1 and Smad7 were determined by Western blot. RESULTS: Rhein significantly attenuated the experimental alveolitis, pulmonary fibrosis, lung coefficient and hydroxyproline contents in the rats. Rhein obviously decreased the expression of miR-21,and the mRNA and protein levels of TGF-β1, but significantly increased the mRNA and protein levels of Smad7 in the lung tissues. CONCLUSION: Rhein effectively prevents bleomycin-induced pulmonary fibrosis by inhibiting the expression of miR-21 and promoting the expression of Smad7, thus regulating the TGF/Smad signaling pathway to decrease extracellular matrix deposition.

Rhein; Pulmonary fibrosis; MicroRNA-21; Transforming growth factor-β1; Smad7

1000- 4718(2017)01- 0149- 05

2016- 06- 16

2016- 08- 22

河南省科技公关项目(No. 122102310200)；新乡市经济社会发展重点科研项目(No. S10008)；新乡医学院第七批省级重点学科开放课题(No. ZD200903);新乡医学院培育基金资助项目(No. 2014QN130)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.025

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0373-3029101； E-mail: chong29@126.com