复方莪术散对子宫内膜异位症黏附因子表达的影响

薛丽霞

天津中医药大学(天津300193)



·实验研究·

复方莪术散对子宫内膜异位症黏附因子表达的影响

薛丽霞

天津中医药大学(天津300193)

目的:观察子宫内膜异位症ICAM-1的表达情况，并探讨复方莪术散对其表达的影响。方法 :建立子宫内膜异位症大鼠模型，WB检测不同子宫内膜组织ICAM-1的表达；并取异位细胞进行原代细胞培养，同时用高中低剂量复方莪术散干预子宫内膜异位症异位原代培养细胞，分别在24 h、48h和72 h利用WB检测ICAM-1的表达情况。结果: WB结果显示，与非内异症大鼠正常子宫内膜组织相比，子宫内膜异位症大鼠在位组织和异位组织ICAM-1相对表达量升高，差异具有统计学意义，其中异位组织较在为组织ICAM-1升高更为明显(P<0.05和<0.01)。独立样本t检验显示，高中低剂量复方莪术散干预组表达明显降低，差异具有显著性(P<0.05)。结论: ICAM-1蛋白子宫内膜异位内膜组织呈现高表达，而复方莪术散能够有效抑制子宫内膜异位内膜细胞ICAM-1蛋白的表达，为治疗子宫内膜异位提供了良好的方法。

子宫内膜异位症简称内异症，其典型病理特征是子宫内膜腺体和间质出现在子宫内膜以外的部位，且生长、浸润、反复出血，可形成结节及包块，是引起疼痛和不育的主要原因[1]。据估计育龄妇女中内异症的流行率约为10%～15%，而50～60%各种形式盆腔痛的育龄女性和青春期女性和50%的不育女性均合并内异症[2]。内异症虽然为良性病变，却具有恶性行为，复发率高，严重影响女性的身心健康[3]。目前，其病因和致病机制复杂，有子宫内膜种植学说、体腔上皮化生学说、淋巴和静脉播散学说等[4]。其中，“经血逆流种植”学说最为经典。异位的子宫内膜通过“黏附-侵袭-血管生成”侵袭其他部位[5]，其间涉及众多粘附因子包括细胞间黏附因子-1(ICAM-1)、CD44、CA125、CA199等。研究显示，异位内膜ICAM-1和CD44表达增高[6]。中医认为血瘀是该病致病的关键。中药方剂复方莪术散具有补肾活血、软坚散结等功效，治疗内异症具有良好效果[7]。本研究通过建立子宫内膜异位大鼠模型观察病变组织ICAM-1表达的变化，然后利用不同剂量复方莪术散干预子宫内膜异位症异位细胞并其对ICAM-1表达的影响，以确证其对黏附作用的影响。

材料和方法

1 实验材料 清洁级雌性SD大鼠(由上海生命科学院实验动物中心提供，合格证：SYXK沪2004-0012)、苯甲酸雌二醇、异戊巴比妥那、大鼠饲料(上海斯莱克实验动物有限责任公司)、复方莪术散(方药组成：三棱、莪术、淫羊藿、延胡索、黄芪，组方中个单药剂量由江阴天江药业有限公司制成颗粒剂型，其中低剂量各单药5 g， 中剂量10 g,高剂量20 g)、DMEM培养基、组织匀浆器、RIPA裂解液(碧云天生物技术公司)、RIPA蛋白裂解液(碧云天生物技术公司)、β-actin抗体(碧云天生物技术公司)、抗ICAM-1抗体(Sigma公司)、HRP-山羊抗小鼠二抗(碧云天生物技术公司)、ECL化学发光试剂盒(碧云天生物技术公司)、

2 子宫内膜异位大鼠模型建立 实验动物为6～8周龄，健康成熟未交配的清洁级雌性SD大鼠，平均体重165～182 g，按照清洁级动物要求进行饲养，自由取水，室温24℃，相对湿度50±10%，明暗照明各12 h，实验前适应性饮食2周。动物模型建立参照文献[8]，简要步骤如下：按照30 μg/kg剂量连续皮下注射苯甲酸雌二醇3D，阴道涂片观察以确定大鼠动情期，在动情期进行手术造模。按60 mg/kg剂量腹腔注射异戊巴比妥那进行麻醉，无菌条件下剖腹，结扎子宫系膜血管，左侧子宫纵向切开，分离出子宫内膜0.5 cm× 0.5cm并缝合于右侧腹腔内壁血管丰富处。术后三周剖腹，测量异位内膜体积，以体积≥20 mm3、内膜囊泡见透明积液为造模成功。

3 细胞培养及低、中、高剂量复方莪术散干预处理 选取建模成功大鼠异位子宫内膜组织保存在DMEM培养液中，2h内进行细胞培养处理。细胞原代培养方法参照Ryan[9]等的方法，简要步骤如下：PBS将内膜组织洗涤3次；用眼科剪将其剪成碎块，加入2～5倍体积的消化液(含1%胶原酶和0.25%胰蛋白酶)，于细胞培养箱中消化90 min，至可见葡萄串状上皮细胞及单个间质细胞。将消化好的细胞悬液离心去上清，加入DMEM漂洗沉淀2次后，加入DMEM完全培养基，吹打混匀后接种于培养瓶中，37℃，5%CO2培养箱培养。应用免疫组化染色法鉴定上皮细胞(角质蛋白染色)和间质细胞(波形蛋白染色)。将对数生长期的培养细胞分别应用含低、中、高浓度的复方莪术散DMEM完全培养基进行培养。分别在培养24 h，48 h及72 h后，收集细胞。

4 WB检测ICAM-1表达

4.1 细胞和组织蛋白的提取组织蛋白提取：分别取适量非内异症大鼠正常子宫内膜组织、子宫内膜异位症在位组织和异位组织至匀浆器球状部位，用干净组织剪将其剪碎；加入400μl RIPA裂解液(碧云天生物科技有限公司)于匀浆器中，冰上匀浆；冰上裂解30 min，将裂解液转移至1.5 ml EP管中，超声10～15 s后，4℃，12,000rpm 离心5 min，收集上清于离心管中，-20℃保存备用。细胞蛋白提取：将相应处理时期的细胞，弃培养基，加预冷PBS洗2次，将PBS弃净后置于冰上，加RIPA裂解液200μl冰上裂解30 min。刮取细胞并将裂解液转移至EP管中，超声10～15 s后，4℃，12,000rpm 离心5 min，收集上清于离心管中，-20℃保存备用。

4.2 WB检测:应用WB检测组织和细胞ICAM-1的表达情况，简要步骤如下：利用将10%的蛋白电泳分离胶和4%的蛋白电泳浓缩胶进行蛋白电泳；用PVDF膜进行转膜； 用8%脱脂混匀牛奶封闭2 h；按1∶1 000稀释β-actin抗体和抗ICAM-1抗体，4℃孵育过夜；洗涤过后1∶10 000比例用TBST稀释结合辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育2 h；洗涤后曝光显影。用凝胶图像处理系统分析目的条带，并用ImageJ图像采集分析系统计算WB灰度值，以样品条带/β-actin相对含量为蛋白含量的表达。

5 统计学方法 应用SPSS 16.0 统计学软件，结果以均数±标准差表示，组间均数比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 细胞形态观察 细胞体外培养24 h后，大部分上皮细胞已贴壁呈团状生长排列，腺细胞呈多角形或蝌蚪形，为致密的细胞集落，边界清楚。间质细胞为多角形或梭形。

2 子宫内膜异位大鼠不同子宫内膜组织ICAM-1表达 WB结果显示，与非内异症大鼠正常子宫内膜组织相比，子宫内膜异位症大鼠在位组织和异位组织ICAM-1相对表达量升高，差异具有统计学意义，其中异位组织较在为组织ICAM-1升高更为明显(p<0.05和<0.01)，见图1。

图1 不同子宫内膜组织ICAM-1表达

2 复方莪术散对子宫内膜异位原代细胞ICAM-1表达的影响 WB结果显示，空白对照组ICAM-1蛋白高表达；复方莪术散高剂量干预组与空白对照比较，复方莪术散高、中、低剂量干预组ICAM-1蛋白表达量明显减少，具有统计学差异(P<0.05)(见表1)。

表1 不同剂量复方莪术散干预后细胞ICAM-1表达变化

注：与空白组比较，*P<0.05

讨 论

复方莪术散包括莪术、三棱、淫羊藿、延胡索和黄芪5味中药，活血化瘀、行气止痛、益肾扶正[10]。动物实验表明，该药可降低异位内膜血管内皮生长因子及基质金属蛋白酶的表达，抑制新生血管形成及病灶侵袭[11]。ICAM-1是一种淋巴细胞功能相关抗原-1的配体，含有505个氨基酸，属于细胞粘附分子中的免疫球蛋白超级家族一员，广泛存在于细胞表面和细胞外基质包括子宫内膜上皮细胞和细胞间质。其不仅可以介导细胞-细胞间黏附作用，也参与细胞信号转导、血管生长、炎症反应等生理和病例过程[12]。子宫内膜间质细胞有较多的ICAM-1表达。多种研究证实，该蛋白在内异症患者血清中明显升高[13]；在异位病灶中高表达[5, 14]。该蛋白可能在内异症的发生发展中起着重要作用。

本研究成功建立了子宫内膜异位症大鼠模型，并观察了ICAM-1在非内异症大鼠正常子宫内膜组织、在位组织(P<0.05)和异位组织的表达情况。结果发现，子宫内膜异位症在位组织和异位组织ICAM-1的表达均增高，其中异位组织ICAM-1增高最多，提示ICAM-1可能在内异症的发生发展中起着在重要作用。同时，本研究利用不同剂量复方莪术散干预子宫内膜异位内膜细胞，并观察了其对ICAM-1蛋白表达的影响。结果发现，复方莪术散能有效抑制该蛋白在子宫内膜异位内膜细胞的表达，提示复方莪术散治疗子宫内膜异位症有重要作用。其可能通过抑制ICAM-1蛋白表达，影响异位子宫内膜的黏附从而达到治疗的效果。

综上所述，ICAM-1在子宫内膜异位症在位组织和异位组织升高，而复方莪术散能够有效抑制子宫内膜异位内膜细胞ICAM-1蛋白的表达，为治疗子宫内膜异位提供了良好的方法。

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(收稿：2016-09-22)

The effect of compound rhizome curcumae power on intercellular adhesion molecule-1 in endometriosis

Xue Lixia.

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine (Tianjin 300193)

Objective:To observe the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in endometriosis and study the effect of compound rhizome curcumae power on ICAM-1. Methods :The endometriosis rat model was established and we used WB to detect the expression of ICAM-1 in different endometriosis tissues; then we collected the cells of endometriosis and cultured. The cultured endometriosis cells were treated with low, middle and high concentration of compound rhizome curcumae power and the ICAM-1 expression was detected by WB at 24h, 48h and 72h after treated. Results:WB showed that compared with normal tissues, there were significantly higher ICAM-1 expression in ectopic and eutopic endometrium tissue (P<0.05), but more higher in ectopic tissue (P<0.01). And independent sample t test showed the expression of ICAM-1 were lower in the cultured endometriosis cells treated with low, middle and high concentration of compound rhizome curcumae power. Conclusion: The expression of ICAM-1 is higher in endometriosis tissues and compound rhizome curcumae power could effectively depress the expression of ICAM-1, which gives good method for the treatment of endometriosis.

Endometriosis @Compound rhizome curcumae power Intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) Animal ，Experimentation Rats

子宫内膜异位症 @复方莪术散 细胞间粘附因子-1 动物，实验 大鼠

R711.71

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.01.061