胃食管反流病的生物标志物

韩 英

(陆军总医院 消化内科，北京 100700)



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胃食管反流病的生物标志物

韩 英

(陆军总医院 消化内科，北京 100700)

胃食管反流病(GERD) 是胃内容物反流所导致的一组疾病，没有单一的生物标志物能够反映整个疾病谱。GERD生物标志物对内镜阴性、常规pH阻抗监测无异常的食管疾病的判别有价值。组织病理学标志物、基线阻抗和血清学检测(反映食管黏膜完整性)、量化黏膜完整性受损程度的基线黏膜阻抗、反映连接蛋白的蛋白水解片段已经成为一组有前景的GERD生物标志物。

胃食管反流；细胞黏附分子；免疫组织化学

韩英，主任医师、教授、博士生导师。原北京军区总医院副院长、消化内科主任；中华医学会消化分会委员兼司库；北京医师协会消化分会常务理事；Gastroenterology，Gut中文版 副主编；Journal of Crohn's and Colitis中文版编委；Journal Digestive Disease，《中华消化杂志》等杂志编委。

基于蒙特利尔共识，GERD是泛指胃内容物反流入食管所致的一组疾病。 GERD诊断可以基于组织学损伤和(或)由于反流所致的症状和不适。尽管该定义看似很全面，但是由于GERD的临床表现多样性，其潜在的相互关系错综复杂，因此对临床医师提出了挑战[1]。

从概念上讲，可以大致分为病理损伤、胃食管交界处功能、传入敏感性、神经肌肉功能或症状认知异常等。此外，由于蒙特利尔共识的“全面性”，每一个GERD患者都可以在上述范围内找到相对应的领域，因此无法获得一个诊断性试验的金标准。因此，GERD或难治性GERD已成为消化内科临床转诊疾病中最常见的诊断[1]。

在实际临床工作中，患者主诉咽喉痛、咳嗽或胸痛，考虑其为难治性GERD时，临床医生应该处置?虽然上述症状可能与GERD有关，但是这些症状并非是GERD的特异性表现， 往往可能误诊。所以，采用一种生物标志物来评估与病变相关的反流参数应该有一定的价值。美国国立卫生研究院(NIH)生物标志物定义工作组(National Institutes of Health Biomarkers Definitions Working Group)将生物标志物定义为：“具有可客观检测和评价的特性，可作为正常生物学过程、病理过程或治疗干预的药理学反应的指示因子”。世界卫生组织的定义：“在人体内可以检测的任何物质、结构、过程，以及影响或预测疾病或转归的产物”。基于上述这些定义，生物标志物与患者自诉的症状或病情转归无关。

在GERD的情况下，由于潜在的疾病表现较多，没有单一的生物标志物可以反映其疾病谱，因此非常有必要探索一组反映GERD相关病理学的GERD生物标志物。内镜下采用洛杉矶和布拉格分类对食管炎和巴雷特的化生进行分级法已在临床广为应用。本文重点关注生物标志物，期望其有助于临床识别和处置非糜烂性反流性疾病患者(NERD)、功能性烧心(FH)、食管外综合征、反流监测阴性以及内科保守治疗或外科手术治疗后反流症状持续存在者。

1 组织病理学生物标志物

1.1 细胞间黏附分子 排除反流性食管炎所致的黏膜损伤、巴雷特化生、腺癌，或消化性狭窄后的NERD患者进行黏膜损伤的生物标志物检测。从肉眼观察正常黏膜处取活检标本进行组织学评估：基底细胞增生，乳头状延伸，上皮内嗜酸性粒细胞，嗜中性粒细胞，单核细胞增多以及细胞间隙增宽(DIS) 是GERD的显微镜下特征，即使在非糜烂食管炎病例亦可见到。

从力学上看，食管上皮的完整性对于防止有害反流成分(包括胃酸、胃蛋白酶、胆汁酸等)的屏障维护至关重要。食管上皮细胞-细胞连接(包括紧密连接、黏附连接及细胞桥粒)为食管上皮相对不可渗透性提供了一个结构框架。因此，反映上述紧密连接的合成或降解的物质可视为GERD的生物标志物。GERD动物实验和体外模型研究Claudin(紧密连接蛋白)-3和Claudin-4表达及定位改变。人体研究发现，GERD患者Claudin-1和Claudin-2、ZO-1，Occludin (紧密连接蛋白)和Filaggrin(中间丝相关蛋白)表达异常，但与组织病理学参数(如DIS和基底细胞增生)无相关性[2-3]。NERD患者中上述蛋白的表达无明显变化[2]。此外，尚无有关酸暴露和病理之间直接相关性的证据。Arul等[4]最近的一项研究检测了食管腔内酸对上述蛋白质的功能完整性和表达的影响。虽然他们通过测量跨膜电阻、旁细胞示踪剂扩散和免疫荧光法观察到灌注酸和弱酸溶液成功诱导黏膜完整性受损，但是并未观察到上述黏附分子表达的相应变化。因此，作者认为，有可能是分子的“再分配”，而不是分子表达水平的改变引致黏膜屏障受损。值得注意的是，有数据表明十二指肠内容物(包括胆酸、脱氧胆酸和胰蛋白酶)而不是胃酸，可以调节细胞的紧密连接功能。与紧密连接蛋白不同，已有证据表明桥粒蛋白的基因表达上调。95例GERD患者(51例糜烂性食管炎)和27例无症状对照组的比较研究中，GERD患者食管上皮屏障黏膜桥粒成分的基因表达上调1.7～8.1倍。 这些患者的组织学变化包括DIS，基底细胞增生，乳头伸长等。该结果提示：与紧密连接蛋白相比，桥粒蛋白更有可能作为反映黏膜损伤的标志物。

尽管对细胞黏附分子表达的鉴别特征尚存争议，近来一项关于紧密连接蛋白的蛋白水解标志物的报道令人鼓舞。无论是基因敲除小鼠模型和GERD患者组织的研究发现，将E钙黏蛋白(E-cadherin)水解(或敲除使之缺乏)对于诱导食管上皮细胞连接的通透性至关重要。E钙黏蛋白水平可通过检测血清可溶性N端的分子片段的增加来判定。根据20例GERD(有或无食管炎病史)与23例无症状者对照研究的结果，研究者推测：血清中这些蛋白裂解片段的检出有可能成为一个有价值的GERD生物标志物。但是该假设需要大样本、不同病理改变的患者人群进行验证。

1.2 细胞间隙增宽 紧密的上皮屏障可以防止上皮下间隙损伤。DIS可作为糜烂性和非糜烂性GERD重要的病理组织学特征，并藉此与健康志愿者和FH患者相鉴别。DIS被认为是上皮通透性的标志物或Ussing灌流室(Ussing chamber)研究中细胞间糖复合物重排导致“分流泄漏(shunt leak)”的标志物，形成可允许20 000以下的大分子物质、水和氢离子通过的跨膜通道。通透性的增加导致水肿，导致与痛知觉有关的食管化学敏感性痛觉感受器激活。该假说似乎合理解释了非糜烂性GERD对反流物高敏的机制，并有一些研究支持该假说[4]。一项研究对“烧心”患者进行评估，发现显微镜下食管炎(包括DIS)可以准确区分客观反流综合征(非糜烂性GERD和高敏食管)与FH，后者在病理组织学上与健康志愿者差异无统计学意义。

从治疗角度来看，质子泵抑制剂(PPI)已被证明是糜烂性食管炎最有效的药物，而对非糜烂性GERD疗效欠佳。NERD患者对PPI抵抗可能是由于非酸性反流物导致永久性DIS。另有文献报道DIS(和酸暴露)在NERD患者的食管向近端延伸，因而导致症状感知性增高。

尽管不能将DIS作为鉴别GERD与FH的标准，但是DIS对GERD诊断因缺乏特异性，而限制其作为一种生物标志物的重要因素。DIS对酸诱导的损伤并非特异，因为弱酸反流亦可引发DIS。此外，食管活检部位对DIS评估亦存在争议。更重要的是，在情绪应激、嗜酸细胞性食管炎、服用阿司匹林以及念珠菌感染时亦可见到DIS[5]。此外，虽然无症状对照研究确认酸暴露可导致DIS，但是这些改变与症状感知并无相关性，从而提出NERD患者超敏反应可能与其他因素有关。DIS的意义可能在于其阴性预测值：无DIS可考虑诊断FH[1]。从技术角度分析，透射电子显微镜测量DIS具有良好的敏感性和特异性，但价格昂贵，不能广泛使用且耗时较久。另外，光学显微镜检出DIS无法与电子显微镜相比[1]。

1.3 免疫组织化学标志物 鉴于GERD尚无特异性病理组织学标志物，希望通过免疫组织化学研究探寻特异性生物标志物。作为促炎生物标志物的蛋白酶激活受体(PAR-2)被认为在改变跨膜电阻和介导内脏感觉过敏中发挥作用。Abd El-Rehim等[6]发现与正常对照者比较，GERD患者PAR-2过表达，而糜烂性与非糜烂性病例之间差异无统计学意义。GERD患者PAR-2基因表达上调，与IL-8表达及GERD组织病理学改变相关。辣椒素敏感的瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1(TRPV1)和蛋白基因产物9.5(神经元和超敏反应标志物)已在GERD(特别是NERD)患者进行评估。NERD患者酸暴露总时间与蛋白基因产物9.5和TRPV1受体表达密切相关，表明酸在上调这些超敏标志物方面发挥作用。值得注意的是食管活检组织中蛋白基因产物9.5缺失与PPI疗效差有关，此点有助于鉴别NERD和FH。“鸟枪法”定量蛋白质组学和免疫组织化学分析评估内镜下肉眼正常的NERD与食管炎患者黏膜活检标本，在NERD患者黏膜标本中检出一些特异蛋白质，而糜烂性食管炎则未能检出。这些特异性蛋白质包括过渡内质网三磷酸腺苷酶，α1-酸性糖蛋白1、膜联蛋白A1和钙调素等。作者认为NERD和糜烂性反流病可能是不同疾病，参与细胞增殖、角化和应激反应的蛋白质可作为鉴别两者的生物标志物。

2 基线阻抗(BI)检测

定性和定量评估反流物的常规方法是24小时pH阻抗监测，但是该法对于GERD(尤其是NERD)评估的敏感性和特异性变异较大。由于该检测导致患者不适、依从性差，且对症状主诉的依赖性较大，因此不适合作为潜在的生物标记物[1]。理论上而言，常规的阻抗测量可以区分食管腔内液体和气体并确定其流动方向，是检出和判定反流的最准确方法。然而，该检测法并未转化为能够准确区别GERD、NERD、FH、食管高敏以及健康志愿者。阻抗技术的另一种用途是双向BI，测定在没有吞咽或反流事件的情况下食管黏膜的静息阻抗。从概念上讲，BI可以反映黏膜的完整性，类似于跨膜电阻Ussing灌流室测定，该法已成为一个反映黏膜完整性、不依赖患者症状主诉、具有潜在价值的生物标志物。BI与跨膜阻抗相关，与健康志愿者相比，GERD患者(糜烂和非糜烂)BI值较低，提示BI可作为一个可靠的GERD生物标志物。GERD患者BI与传统标志物之间的相关性，其结果表明反流事件中酸暴露时间延长及DIS与低BI相关。 Savarino等[7]证实了GERD患者BI与病理组织学标志物的相关性，与健康志愿者或FH患者相比，糜烂性与非糜烂性GERD患者BI降低。最近的一项研究发现，低BI值与pH监测发现食管酸暴露相关，酸灌注(Bernstein)试验阳性者BI值降低。

鉴别NERD和FH是临床医师面临的挑战。Kandulski等[8]最近通过检测52例NERD、食管炎和FH患者BI，发现临界值<2 100 Ω 可以鉴别GERD(糜烂和非糜烂)与FH，其敏感性78%，特异性71%；远端食管DIS与BI呈负相关。 Martinucci等[9]研究了一组FH患者，服用PPI后症状缓解50%以上FH者BI值较低，而症状缓解不明显的FH及健康志愿者则BI相对较高。此外， Bortoli等[10]发现，FH敏感患者PPI治疗无应答者和健康志愿者相比有较低的阻抗值，提示BI有助于预测PPI疗效反应。

对于治疗前BI值低的难治性GERD患者PPI治疗后BI值显著增高，但未达正常值。Rinsma等[11]研究发现，与安慰剂组相比，GERD婴幼儿服用PPI后BI值升高。近来有研究对内镜下胃底折叠与PPI治疗烧心的疗效进行评估，结果发现两种方法均可部分改善BI值(与健康志愿者组相比)，但是另有研究报道与烧心症状改善的无相关性。Mauritz等[12]也证实接受腹腔镜胃底折叠术的儿童术后BI水平升高并伴随反流减少。然而，对PPI 有效与PPI无效的NERD患者的BI值差异无统计学意义。

3 BI与食管外综合征

GERD食管外表现 (慢性咳嗽、哮喘、和喉炎) 对消化医师的诊断和治疗均具有挑战性。因为上述慢性症状往往见于无典型胃灼热和反流症状的GERD患者。显然，此种情况下，可靠的生物标志物具有较高的诊断价值， 尤其是已经证实传统的pH-阻抗测试对诊断此类病变价值有限。由于BI值对食管综合征的诊断具有令人鼓舞的数据，因此不少研究者也将BI值用于评估食管外综合征。 Woodland等[13]从力学的角度对健康志愿者近端和远端食管BI值进行测量，结果发现健康志愿者远端食管BI值下降，但黏膜降钙素相关基因肽(一种神经敏感性标志物)多位于食管近端表层，该现象或许可以解释为何该区域的敏感性增高。该结果对于研究过敏、慢性咳嗽及喉炎患者有一定帮助。

Ribolsi等[14]最近观察了156例慢性咳嗽患者(PPI有效者43.5%，PPI无效者56.5%)，发现低BI值或有病理性酸暴露者PPI有效的概率较高。对慢性咳嗽、典型GERD和健康志愿者的BI值的对比观察结果表明，与典型GERD患者相比，慢性咳嗽患者食管近端和远端BI值降低；但两者BI值均低于正常对照者。然而，与咳嗽患者相比，典型GERD患者反流及近端反流较多。因此作者认为，低BI值的咳嗽患者可能与反流无关。Lee等[15]发现在喉咽反流(LPR)患者中远端食管BI值与远端食管酸暴露时间呈负相关，但在近端食管两者之间无相关性，提示近端食管黏膜完整性在LPR患者发病中发挥作用。Choi等[16]测量了77例非心源性胸痛的BI值，结果发现非心源性胸痛患者下食管括约肌(LES)以上3 cm处的BI值与正常对照者差异并无统计学意义，但是非心源性胸痛患者LES以上17 cm处的食管近端BI值低于正常对照。

4 BI测量的替代方法

尽管已有研究结果显示BI值可作为 GERD生物标志物，但是BI值仍存在一定的技术局限性。传统的BI测量是基于导管的 pH阻抗研究，检测过程中患者感觉不适甚或痛苦。目前尚无有关24小时BI跟踪测量的部位、时间及具体检测方法的共识。因此，研究人员正在研制专为测量BI的仪器设备。

组织电阻抗光谱法是一替代检测仪器， 该仪器通过内镜孔道在内镜检查时快速测量食管黏膜完整性。2011年首次动物实验证实，与健康志愿者相比，糜烂性食管炎患者组织电阻抗光谱法测定的阻抗值(在正常黏膜区域获取的检测数值)和传统的跨上皮阻力及Ussing灌流室检测的通透性数值间具有良好相关性。然而，有关NERD患者的相关性数据尚无文献报告。Manambe等[17]最近报道了采用生物电导纳法(通过内镜检测生物电导纳)进行阻抗测量，结果发现Ussing灌流室测定的组织阻抗与导纳之间存在负相关性。另有学者报道一种(带有传感器的单通道、黏膜阻抗导管)通过上消化道内镜的孔道进行阻抗测量的微创技术，其检测结果与传统导管测量的BI值相近，即GERD患者的黏膜阻抗值低于健康志愿者。Kim等[18]在2015年美国消化系统疾病周(DDW)期间发表的一篇文献摘要中对传统BI检测与黏膜阻抗检测进行比较，提出黏膜阻抗检测法的变异性较小。

Ates等[19]运用该微创技术对61例糜烂性食管炎、81例NERD、健康志愿者以及其他疾病患者(贲门失弛缓和嗜酸细胞性食管炎)进行随访观察。结果发现：GERD黏膜阻抗值明显低于对照组和贲门失弛缓患者，有助于鉴别诊断。值得注意的是，嗜酸细胞性食管炎患者阻抗测量亦降低，但有别于GERD之处在于：GERD患者食管近端的阻抗值增高，而嗜酸细胞性食管炎患者的食管各段均一呈现低阻抗值。此外，抑酸治疗后GERD患者的阻抗值可以恢复正常。

5 结语

本文系统综述了GERD相关的生物标志物，而这些生物标志物与内镜所见和传统pH阻抗监测无关。主要结论是：鉴于GERD的异质性，没有哪个单一的生物标志物可以对GERD进行预测。最令人鼓舞的研究成果集中在对食管黏膜完整性以及反流损伤的后果进行判定方面。虽然上述领域的检测方法有待于改进，近期的研究成果令人瞩目，例如可以在内镜检查中检测食管黏膜阻抗的设备引发关注。

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Biomarkers of gastroesophageal reflux disease

Han Ying

Department of Gastroenterology， the Army General Hospital， Beijing 100700， China

Han Ying， Email: yh721303@sina.com

Gastroesophageal reflux disease (GERD) is a group of diseases caused by reflux of gastric contents, no single biomarker can reflect the whole spectrum of disease. GERD biomarkers are valuable for the diagnosis of esophageal disease without abnormal endoscopic and conventional pH impedance monitoring. Histopathological markers,baseline impedance and serological tests (reflecting esophageal mucosal integrity), quantifying the degree of mucosal integrity impairment of the baseline mucosal impedance, reflecting the proteolytic fragments of connexins have become a promising group of GERD biomarkers.

gastroesophageal reflux；cell adhesion molecules；immunohistochemistry

韩英，Email：yh721303@sina.com

R573.9

A

1004-583X(2017)01-0005-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.01.002

2016-12-12 编辑:王秋红