胶体金免疫层析技术在食品安全检测中的应用

杨杰，李迎秋

（齐鲁工业大学食品科学与工程学院，济南 250353）

胶体金免疫层析技术在食品安全检测中的应用

杨杰，李迎秋*

（齐鲁工业大学食品科学与工程学院，济南 250353）

胶体金免疫层析技术是以免疫层析技术、胶体金标记技术相结合的一种新型免疫学技术，具有精确、快速、特异、高效、便捷等特点，较适用于基层和现场快速检测。文章主要论述了胶体金免疫层析技术的特点、基本原理和方法，并详细介绍了该技术在药物残留、病原微生物、生物毒素方面的应用现状，结合该技术的优缺点对以后的发展方向进行了展望。

胶体金免疫层析；原理；应用

胶体金免疫层析技术（Colloidal-Gold Immunochromatography Assay，GICA）是20世纪末发展起来的一种新型体外诊断技术［1］，显色物是胶体金，载体是硝酸纤维膜，在层析过程中就可以达到检测的目的［2］。胶体金免疫层析技术的稳定性强、体积小、方便快捷、敏感特异、不需要辅助仪器和试剂且操作人员不用进行技术培训，方便于广大基层检验人员，检测结果判断清楚直观，用时短，可对大批量样品进行现场检测和大面积普查等，具有很大的发展潜力和广阔的应用前景，并开始逐步应用于食品安全的快速检测。

1 胶体金免疫层析技术概述

1.1 概述

胶体金是在还原剂如硼氢化钠、柠檬酸三钠、鞣酸等的作用下，通过氯金酸（HAuCl4）聚合成为大小一定的金颗粒，在静电作用下形成一种稳定的胶体状态，称为胶体金［3］。这些颗粒具有较高的电子密度和较强的蛋白质吸附性能，聚集成一定密度后就会形成能用肉眼观察的粉红色斑点，可用作指示剂［4］，用于定性或者半定量的检测中。胶体金易于存储、制备且价格比较低廉，应用范围广，可以检测多种物质，同时具有高度的灵敏性和特异性，对细胞组织的非特异性吸附作用较小，检测速度快，可靠性很高［5］。

1.2 原理

硝酸纤维素膜是一种条状纤维层析材料，可以作为固相载体，在干燥的硝酸纤维素膜上分别喷涂抗原或抗体（T线，检测线）和相应的二抗（C线，控制线），形成两条固定的隐形线。待检样品加在试纸条一端，样品溶液在微孔膜的毛细作用下在层析条上发生泳动。因T线中含有抗原或抗体，带有游离胶体金颗粒的待测液进入T线，与样本中的待检物发生高特异性、高亲和性的结合反应，免疫复合物的形成富集或被困在一个特定区域的层析试纸条（检测线）［6］，这些标记物（胶体金颗粒）在配位体上大量地聚集，可得到直观的实验现象（颜色），而游离的标记物则会越过检测带，当待测液到达C线后，由于C线中含有抗待测液中的抗体或抗原，因此又会发生特异性结合使之显色，以此来达到检测目标物质和质量控制的目的［7］。胶体金免疫层析可用于定性的快速免疫检测方法中。

1.3 胶体金免疫层析的方法

胶体金免疫层析目前检测的主要方法有间接法、夹心法、竞争法以及捕获法。

1.3.1 间接法

间接法是用免疫金来标记二抗，而没有标记的特异性抗体与已知抗原结合，并固定在T线上［8］，间接法常用来检测血清样本中的病毒如梅毒诊断试剂盒。

1.3.2 夹心法

1.3.2.1 双抗体夹心法

用免疫金标记针对待测抗原某一表位的单抗，针对另一表位的单抗包被在T线上，常被用来检测病原微生物性的大分子抗原［9］，如检测HCG的早孕检测试纸条。

1.3.2.2 双抗原夹心法

用免疫金标记已知抗原，另一已知抗原包被于T线上，常用来检测血清样品中特异性抗体，检测的是总抗体［10］，如乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒。

1.3.3 竞争法

将胶体金抗体与相对应的抗原结合，固定在T线上，若仅有C线显色即为阳性结果，若C线和T线都显色即为阴性结果，与前两种方法原理是相反的，常用来检测小分子的抗原，如吗啡、农药残留、滥用药物的检测等［11］。

1.3.4 捕获法

用于检测感染人体后病原微生物抗体，因为这些病原微生物寄生在细胞内，很难直接检测到其特异性抗原［12］，如风疹病毒、艾滋病毒等，还能检测较难采集标本的病原体。

2 胶体金免疫层析技术在食品安全检测中的应用

近几年食品安全问题层出不穷，不仅对我国食品行业的发展造成了严重打击，而且给我国经济造成了巨大的损失。近几年相关行业加快了食品检测技术的研究，可以利用更先进的检测技术对食品进行有效、快速的检测，胶体金层析技术具有检测速度快、成本较低、适合基层人员检测以及低交叉反应性的优点，这项技术应用于食品安全检测分析中，可以更好地促进食品检测技术的发展。

2.1 药物残留的检测

目前农业和畜牧业的快速发展，带来的问题也日益严重，如农业中的农药残留、养殖环节中兽药的滥用以及向食品中添加非法物质（如瘦肉精、三聚氰胺以及β-激动剂等）。这些药物残留不仅能增强细菌耐药性，而且还能通过食物链和环境因素对人体健康造成间接的影响［13］，现已成为困扰世界卫生的难题。虽然检测药物残留的方法很多，但是多数检测方法操作较繁琐、仪器昂贵、费时费力，还受基层应用的限制，但用胶体金免疫层析技术检测药物残留，可以充分发挥其特性，胶体金试剂和样品量非常小，样品的大小可低至1～2μL；检测结果的确定不需要酶标仪、荧光显微镜等昂贵的仪器，且所需时间短，更适合基层人员检测和现场测试，此外，免疫胶体金的实验结果可长时间保存［14］。近年来，胶体金免疫层析技术在药物残留快速检测中的应用也越来越广泛。

农药和兽药的种类很多，利用胶体金免疫层析技术可以制备针对某一种药物的试纸条，检测较为方便、快速。刘莹［15］将有机磷农药与大分子物质偶联，制备了胶体金，并研制了有机磷金标抗体探针，同时对试纸条各个部分做了实验探究，得出最佳体系配方，结果表明研制的试纸条能对9种有机磷农药进行检测，且最低检测限可达0.25 mg／kg。胶体金免疫技术检测的范围较广，灵敏度较高。李向梅等［16］研制出能同时检测牛奶中庆大霉素和13种喹诺酮类残留的胶体金免疫层析法。采用直接竞争法研制出相应的胶体金快速检测试纸条，结果显示无交叉反应。该试纸条的检测限均为20 ng／m L，5 min内完成了整个检测过程，用时较短，检测精准且直观。李超辉［17］通过正交试验，确定了针对克伦特罗胶体金免疫层析试纸条的最佳生产工艺条件，且该试纸条定量检测线性范围为0.1～1.5 ng／g，最低灵敏度达到0.19 ng／g，与传统ELISA方法相比较，可显示这两种方法有很好的相关性。胶体金免疫层析技术检测药物残留具有快速、灵敏度高、特异性强的特点，可达ng～pg检测范围，可同时检测多种药物残留，用胶体金免疫层析法检测食品中药物残留越来越受到人们的青睐。

2.2 食品中病原微生物的检测

食品安全问题中，首要问题是微生物污染。病原微生物引起的食品安全问题越来越严重，主要包括大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等，这些肠道微生物致病菌的存在会对人体健康造成严重的伤害。我们急需一种准确、快速、方便检测微生物的方法，以降低中毒时间的发生率。目前检测病原微生物的主要方法有传统法、生化鉴定法［18］、PCR法［19］和电化学法［20］，传统法对细菌的分离、培养及生化鉴定时间比较长且不易检出潜在的致病菌，对环境及主观因素影响较大［21］，操作繁琐。生化鉴定法要求很高的技术水平和资金投入，需要昂贵的仪器，PCR需要借助琼脂糖凝胶电泳检测，操作人员会受到危险染料和紫外光的危害，这些都制约了在现场的快速检测的应用。

胶体金免疫层析技术不需要昂贵仪器，不用接触到危险品，并且操作简便快速，现已研发出针对沙门氏菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌等病原微生物的试纸条，快速、携带方便。夏诗琪等［22］制备了胶体金和沙门氏菌单克隆抗体，且研制了专门用来检测沙门氏菌的胶体金免疫层析试纸条，这种试纸条能对食品中5种典型的沙门氏菌进行高效快速的检测，具有很好的应用价值。布日额等［23］制备了胶体金并标记了鼠抗致病性金黄色葡萄球菌（S.aureus）IgG，研制出针对牛乳中S.aureus的胶体金试纸条，该试纸条对S.aureus具有很高的特异性，且与其他菌种无交叉反应；具有稳定、快速、特异、灵敏、操作简单等特点，适合于S.aureus的现场快速检测，胶体金免疫层析技术在病原微生物检测中的作用将会越来越突出。

2.3 生物毒素的检测

真菌毒素是比较常见且毒性很高的一种生物毒素，真菌毒素的污染范围较广，种类较多，且易和食品中的有机化合物结合［24］，对消费者的健康造成很大的危害。目前国内食品受毒素污染问题严重，造成这种现象的重要原因是缺少一种灵敏、快速、高效的检测方法［25］。因此，食品质量和安全监督以及现场快速检测食品中真菌毒素的建立具有重要的意义。胶体金免疫层析技术具有快速、敏感、单样品检测、适合广大基层检验人员以及可以现场快速检测等众多优点，比较适合对真菌毒素污染的食品的现场快速检测。

真菌毒素中主要的毒素有：黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素等。黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）是一种真菌代谢产物，黄曲霉毒素有很多种类，其中，黄曲霉毒素B1（AFB1）的毒性最强［26］，杨英等［27］先使用侧流免疫层析技术，建立了检测莲子中黄曲霉毒素B1的胶体金试纸条，该试纸条的灵敏度可达2.5 ng／m L，且该胶体金试纸条的假阳性和假阴性率为0，该法适用于大批量莲子中AFB1的现场快速检测。赭曲霉毒素（Ochratoxins）会对动物和人的肝脏和肾脏造成侵害。赭曲霉毒素有A，B，C和其他7种化学结构类似物，其中赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）对动物和人类影响较大、分布最广，且产毒量最高，毒性也最大。扶胜等［28］用胶体金免疫层析技术对谷物和饲料中赭曲霉毒素A进行了快速检测，结果得出该试纸条对饲料样品的检测限为100 ng／m L，对谷物类样品的检测限为5 ng／m L，且假阴性率为0，假阳性率小于5%。该试纸条有较好的特异性，使用方便简单，适合现场快速检测。贾寅等［29］建立了小麦、稻谷和玉米中玉米赤霉烯酮的胶体金免疫层析快速定量检测法，检出限为5μg／kg，定量限为12μg／kg时，结果符合有关规定。胶体金免疫层析操作简单，可以用肉眼直接观察，结果能长期保存，便于普及和推广。

3 胶体金免疫层析技术的优缺点及其展望

胶体金免疫层析技术具有成本低、结果准确且清晰、不需要特殊设备且携带方便等优点，这些优点都是其他免疫学所无法比拟的。但是在实际研究和应用中胶体金免疫技术仍有一些不足之处：首先，操作时的清洁度、颗粒本身的特性都会对结果造成影响，检测的可重复性程度低；其次，被测样品成分复杂、种类繁多，都会影响胶体金颗粒与蛋白的吸附和抗原抗体之间的反应，试验结果不能实现自动化存储，会造成高假阳性、假阴性几率。

以后的研究趋势可以集中在以下几点：（1）多元检测。可以使用单一膜的检测线上包被多种检测线以及多个或多种层析膜复合使用的形式，可以降低检测的难度，大大节约了检测时间和成本，对于多个指标的检测有重大的使用价值［30］。（2）扩大检测范围，提高灵敏度。特异性抗原抗体的反应信号的扩增，胶体金的显色效果的增大，生物素亲和素系统与一些电化学设备和生物传感器相结合等方法来扩大检测范围［31］。通过生物素亲和素系统和免疫金银染色法加强银染实验或者在膜上进行修饰来提高灵敏度。（3）实现定量或半定量检测。定性检测只有阳性和阴性两种结果，半定量检测时，在膜上相隔一定距离包被几条平行的抗体带，层析后对显色条的数量进行观察，从而将待测物含量确定于某一范围内［32］。在抗体包被量和加样量精确控制的前提下，通过定量分析显色时间的长短，或者通过结合反射光密度计测定光密度的强度得到具体的数字，从而计算定量，这将是免疫胶体金技术未来主要的发展方向。

科技在不断地向前发展，胶体金免疫层析技术有着巨大的发展潜力，相信随着相关技术的不断发展，这项技术能够在食品检测领域得到更广泛的应用。

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Application of Colloidal-Gold lmmunochromatography Assay（GlCA）in Food Safety Testing

YANG Jie，LI Ying-qiu*
（College of Food Science and Engineering，Qilu University of Technology，Ji＇nan 250353，China）

As a kind of novel immunological technique，Colloidal-Gold Immunochromatography Assay（GICA）combines immunochromatography with immunogold labeling technique and it is suitable for the primary and on-site rapid testing with the characteristics of accurate，rapid，specific，efficient and convenient.Mainly discuss the characteristics，basic principles and methods of GICA technology，and its application status in drug residues，pathogenic microorganisms and biotoxins.Combined with the advantages and disadvantages of GICA，its development prospects are expected.

GICA；principle；application

TS201.1

A

10.3969／j.issn.1000-9973.2017.10.037

1000-9973（2017）10-0171-05

2017－04－19 *通讯作者

山东省高校科学与技术发展规划（J13LE02）

杨杰（1990－），女，硕士，研究方向：食品生物技术。