四川省猪、鸡源大肠杆菌对抗生素耐药性研究

岳秀英，葛荣，吴晓岚，陆强，孙吉，宁宜宝，邹立扣

(1．四川省兽药监察所，四川成都610041;2．中国兽医药品监察所，北京海淀100081; 3．四川农业大学，四川都江堰611830)

四川省猪、鸡源大肠杆菌对抗生素耐药性研究

岳秀英1，葛荣1，吴晓岚1，陆强1，孙吉1，宁宜宝2，邹立扣3

(1．四川省兽药监察所，四川成都610041;2．中国兽医药品监察所，北京海淀100081; 3．四川农业大学，四川都江堰611830)

对四川省2009－2014年共2 954株猪、鸡源大肠杆菌进行13种抗生素耐药性测定，同时对耐头孢噻呋大肠杆菌及O157菌株耐药基因进行检测。结果表明:大肠杆菌对抗生素耐药谱广，多重耐药严重。大肠杆菌对抗生素耐药率呈逐年波动下降趋势，猪源大肠杆菌对抗生素耐药率总体耐药率为40.40%～92.32%，抗生素耐药率依次为:TET(92.32%)＞SIZ (91.96%)＞AMP(91.25%)＞SXT(87.56%)＞DO(77.67%)＞FFC(73.97%)＞SH(69.91%)＞EN(66.00%)＞AMC (61.10%)＞OFX(59.39%)＞CN(57.82%)＞PME(42.53%)＞CEF(40.40%)。鸡源大肠杆菌对抗生素的总体耐药率为9.17%－89.41%，抗生素耐药率依次为:SIZ(89.41%)＞AMP(85.01%)＞SXT(83.40%)＞TET(83.01%)＞EN(72.03%)＞OFX(63.37%)＞AMC(62.14%)＞DO(58.90%)＞FFC(55.10%)＞SH(50.52%)＞CEF(46.9%)＞CN(33.91%)＞PME(9.17%)。2009年－2014年猪源大肠杆菌耐药率总体高于鸡源大肠杆菌。研究表明，监测大肠杆菌的抗生素耐药性对动物的养殖、疾病的预防及耐药性的控制有着重要意义。

猪;鸡;大肠杆菌;抗生素;耐药性

随着畜禽养殖中治疗或预防性使用的抗菌药物的广范使用，导致大肠杆菌的耐药性逐渐增强，多重耐药菌株不断增加，给我国畜禽业发展和人类健康带来了极大危害。大肠杆菌头孢噻呋抗菌性强，抗菌谱广，是兽医常用于治疗大肠杆菌疾病的药物。大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌主要血清型，是引起出血性肠炎的主要病原菌。本研究通过对四川2009－2014年猪、鸡源大肠杆菌耐药性测定，并对耐头孢噻呋的大肠杆菌及大肠杆菌O157耐药基因进行检测，分析大肠杆菌耐药性及耐药基因情况，旨在为养殖业中大肠杆菌病的防治提供用药指导。

1 材料与方法

1．1 样品采集2012—2014年间从养殖场采取(鸡:泄殖腔拭子，猪:肛门拭子)样品，保存于冰盒中，48 h内送回实验室。

1．2 培养基及试剂

1．2．1 培养基TSB培养基，麦康凯培养基，TSA培养基，MHA培养基，NB培养，LB培养基，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1．2．2 抗生素β－内酰胺/抑制剂类:阿莫西林/克拉维酸(AMC)、氨苄西林(AMP);头孢类:头孢塞呋(CEF)、头孢唑啉(CFZ);氨基糖苷类:阿米卡星(AK)、庆大霉素(CN)、大观霉素(SH);四环素类:四环素(TET)、多西环素(DO);氯霉素类:氟苯尼考(FFC);多黏菌素类:多黏菌素E(PME);磺胺类:复方新诺明(SXT)、磺胺异噻唑(SIZ);氟喹诺酮类:恩诺沙星(EN)、氧氟沙星(OFX);以上试剂购自中国药品生物制品鉴定所。

1．3 菌株分离、鉴定大肠杆菌的分离、鉴定取拭子样品直接接种于麦康凯琼脂平板，动物组织样品首先制成匀液，然后接种于麦康凯琼脂平板，(36±1)℃培养18～24 h。挑取大肠杆菌可疑菌落，用麦康凯培养基纯化一代，然后接种于营养琼脂平板，(36±1)℃培养16 h～24 h。挑选待鉴定细菌的5～7个单个菌落，采用自动细菌鉴定仪进行鉴定。

1．4 药敏试验根据CLSI推荐的琼脂稀释法测定大肠杆菌的耐药表型［1］，以大肠杆菌ATCC25922及ATCC35218为质控菌株。

1．5 耐药基因检测对耐头孢噻呋大肠杆菌及大肠杆菌O157:H7菌株进行耐药基因检测。大肠杆菌sul1、sul2、sul3耐药基因引物参照Zhou等［2］，qnrA、qnrB、qnrS、qepA耐药基因引物参照Sánchez等［3］，tetA、tetB、tetC、tetG耐药基因引物参照Cheng等［4］、Du等［5］，aph(3＇)－IIa、aac(3)－IIa、ant(3”)－Ia、aac(6’)－Ib耐药基因引物参照Zhang等［6］，blaTEM、blaSHV、blaCTX－M耐药基因引物参照田国宝等［7］，pmrA、pmrB、aadA1、aadA2、aadB耐药基因引物参照邹明等［8］，blaCMY耐药基因引物参照Zhao等［9］，floR耐药基因引物参照于学辉等［10］。

2 结果与分析

2．1 大肠杆菌流行情况2009－2014年，鸡源大肠杆菌分离到1 548株，猪源大肠杆菌分离到1 406株，鸡源大肠杆菌分离率总体呈现为波动式降低趋势，猪源大肠杆菌分离率呈现先升高后降低趋势。2009－2014年检测出23株大肠杆菌O157菌株。

2．2 大肠杆菌对抗生素的耐药性

2．2．1 大肠杆菌对抗生素总体耐药性2 954株大肠杆菌对13种抗菌药物均产生了不同程度的耐药性，耐药率在25.05%～90.62%之间。大肠杆菌对抗生素的耐药率依次为SIZ(90.62%)＞AMP (87.98%)＞TET(87.44%)＞SXT(85.38%)＞EN (69.16%)＞FFC(64.05%)＞AMC(61.65%)＞OFX(64.48%)＞DO(57.92%)＞SH(59.75%)＞CN(45.29%)＞CEF(43.81%)＞PME(25.05%)。从抗生素大类比较，大肠杆菌耐药率依次为:磺胺类(85.38%～90.62%)＞青霉素类(87.98%)＞四环素类(57.92%～87.44%)＞氟喹诺酮类(61.48%～69.16%)＞氯霉素类(64.05%)＞加酶抑制剂类(61.65%)＞头孢类(7.45%～43.81%)＞氨基糖苷类(45.29%)＞多黏菌素类(25.05%)。

2．2．2 猪源大肠杆菌耐药性猪源大肠杆菌对抗生素总体耐药率为40.40%～92.32%，抗生素的耐药率依次为:TET(92.32%)＞SIZ(91.96%)＞AMP (91.25%)＞SXT(87.56%)＞DO(77.67%)＞FFC (73.97%)＞SH(69.91%)＞EN(66.00%)＞AMC (61.10%)＞OFX(59.39%)＞CN(57.82%)＞PME (42.53%)＞CEF(40.40)%。从抗生素大类比较，猪源大肠杆菌耐药率依次为:磺胺类(87.56%～91.96%)＞青霉素类(91.25%)＞四环素类(77.67%～92.32%)＞氯霉素类(73.97%)＞氟喹诺酮类(59.39%～66%)＞氨基糖苷类(57.82%～69.91%)＞加酶抑制剂类(61.10%)＞多黏菌素类(42.53%)＞头孢类(40.40%)。

2009－2014年分离猪源大肠杆菌耐药率总体呈逐年波动下降趋势。2009年猪源大肠杆菌对AMC、AMP、TET、SIZ、SXT的耐药率最高，分别为100%、100%、98.88%及97.21%、96.09%。2010年对AMC、AMP、TET、SIZ、SXT的耐药率均下降，分别为76.33%、92.23%、95.05%、90.11%、92.23%。与2010年相比，2011年分离菌株对AMC、AMP、TET、SIZ、的耐药率有上升趋势，分别为97.50%、99.17%、95.83%、90.42%，而2012年及2013年分离菌株的AMC耐药率却下降为54.07%和8.46%。2013年分离菌株对13种抗生素耐药率明显普遍低于其他年份，耐药率最高的抗生素为TET (84.08%)。

2．2．3 鸡源大肠杆菌耐药性鸡源大肠杆菌对抗生素的总体耐药率为9.17%～89.41%，抗生素的耐药率依次为:SIZ(89.41%)＞AMP(85.01%)＞SXT (83.40%)＞TET(83.01%)＞EN(72.03%)＞OFX (63.37%)＞AMC(62.14%)＞DO(58.90%)＞FFC (55.10%)＞SH(50.52%)＞CEF(46.9%)＞CN (33.91%)＞PME(9.17%)。从抗生素大类比较，鸡源大肠杆菌耐药率依次为:磺胺类(83.40%～89.41%)＞青霉素类(85.01%)＞四环素类(58.90%～83.01%)＞氟喹诺酮类(63.37%～72.03%)＞加酶抑制剂类(62.14%)＞氯霉素类(55.10%)＞头孢类(46.9%)＞氨基糖苷类(33.91%～50.52%)＞多黏菌素类(9.15%)。

2009－2014年分离猪源大肠杆菌耐药率总体呈下降趋势。2009年鸡源大肠杆菌耐药率最高的抗生素为SH(92.93%)和AMC(91.95%)，2010年为SH (92.93%)和SIZ(91.35%)，2011年为AMP (99.01%)及AMC(98.03%)。2012年耐药率最高的为SIZ(93.85%)及AMP(93.46%)。2013年13种抗生素耐药率明显下降，耐药率最高的为SIZ (79.30%)，最低的为AMC(1.40%)。2014年耐药率最高的也是AMP(83.72%)。2009－2014年AMC耐药率变化最大(1.40%～98.03%)，CEF、CN、PME耐药率相对较低。

2009－2014年猪源大肠杆菌和鸡源大肠杆菌对13种抗生素耐药率趋势大致相同，猪源大肠杆菌对抗生素的耐药率高于鸡源大肠杆菌，但AMC、CEF、EN、OFX四种药物鸡源大肠杆菌略高于猪源大肠杆菌。猪、鸡源大肠杆菌对β－内酰胺类、四环素类、磺胺类的耐药性较其他抗生素偏高。

2．2．4 大肠杆菌多重耐药情况表2表明，大肠杆菌表现出严重的多重耐药性。鸡源大肠杆菌的多重耐药菌株占94.13%，其中耐受10种的抗生素菌株最多(15.89%);最多耐受13种抗生素(0.97%);鸡源大肠杆菌多重耐药谱最多的为AMC-AMP-CNDO-EN-FFC-CEF-OFX-SH-SIZ-SXT-TET(4.72%，n= 73)。猪源大肠杆菌多重耐药菌株占96.52%，其中耐受12种的抗生素的菌株最多(14.44%)，最多耐受13种抗生素(9.74%);猪源大肠杆菌最多的多重耐药谱是AMC-AMP-CN-EN-DO-FFC-CEF-OFX-PME-SH-SIZSXT-TET(9.74%，n=137)。

3 讨论

2009－2014年分离2 954株大肠杆菌对13种抗生素呈现出不同程度耐药，对SIZ的耐药率达到90.62%，与其他研究结果相比，猪源、鸡源大肠杆菌对13种抗生素耐药率趋势大致相同，对磺胺类、四环素类耐药率最高。2009－2014年间AMP、AMC和SXT耐药率呈波动下降趋势，TET在6年间耐药率一直较高，到2013年大肠杆菌对所有抗生素的耐药性下降普遍至最低，2014年略有上升。

本研究中对2 954株大肠杆菌对13种抗生素进行了药敏试验，耐药率达到80%以上的抗生素有4种，分别为SIZ、TET、AMP及SXT，建议这4种抗生素停用。尤其是SIZ和AMP已不再适合用于大肠杆菌病的临床治疗;耐药率在50%～80%的药物有6种，有些药物在临床停用边缘，在使用时应作为次选药物;耐药率在50%以下的药物有3种，为CN、CEF及PME，药物还处于敏感的范围，在实际使用中要合理使用。养殖场的盲目用药，不仅会加大经济成本，而且会错过最佳治疗期导致疾病感染增加，还会进一步加大细菌耐药性产生，因此在动物疾病治疗中应考虑合理、准确用药。

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S858．28

B

0529-6005(2017)01-0093-03

2016－01－11

农业部“948项目”(2011－G14);教育部“长江学者和创新团队发展计划”(IRT13083);国家自然科学基金(31400066)

岳秀英(1972－)，女，高级兽医师，博士，主要从事兽药残留和动物源性细菌耐药研究工作，E－mail:582335538@ qq．com

葛荣，E－mail:582335538@qq．com