牦牛支气管上皮细胞的分离培养与鉴定

雷生妍，王光华，马利青，邵方红，张红见，赵 静

(1．青海大学农牧学院，青海 西宁 810016;2．青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016;3．青海大学生态环境工程学院，青海 西宁 810016)

牦牛支气管上皮细胞的分离培养与鉴定

雷生妍1，王光华2，马利青2，邵方红3，张红见1，赵 静1

(1．青海大学农牧学院，青海 西宁 810016;2．青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016;3．青海大学生态环境工程学院，青海 西宁 810016)

为了分离培养牦牛支气管黏膜上皮细胞并传代培养，利用支气管结扎灌注酶冷消化法和支气管组织贴壁法分离培养牦牛支气管黏膜上皮细胞并传代培养，第二代细胞制作细胞爬片通过H.E.染色，扫描电镜和免疫荧光分别对培养的上皮细胞的形态结构进行鉴定，结果两种方法都获得了牦牛支气管黏膜上皮细胞，细胞活性好，纯度高;H.E.染色可见细胞形态呈梭形、圆形、多角形等，细胞核深染，细胞质淡红色;扫描电子显微镜检测中，明显可见细胞的纤毛;免疫荧光鉴定细胞核清晰可见，细胞核呈亮绿色，表明分离培养的细胞为上皮细胞，可进一步为牦牛支气管黏膜上皮细胞粘附模型的建立提供材料和奠定技术基础。

支气管黏膜上皮细胞;分离;鉴定;培养

支气管上皮细胞在哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、肺囊性纤维化以及一些感染性呼吸道疾病的发病机制中均起着重要的作用［1］。细胞培养是研究病毒与研制疫苗的基础技术，细胞培养的培养物可为单个细胞或细胞群，但细胞培养工作十分繁琐，环节较多。标准无菌室的设计、物品的准备、工作规则的制定及注意事项都是细胞培养顺利完成的先决要素［2］。动物细胞培养是医学，生物研究中广泛采用的技术方法，即分为原代和传代培养，有贴壁培养和悬浮培养，细胞生长具有特殊的生物学性质，需要无菌、恒温和充分的营养环境。

国内外已经解决和改善了多种动物如牛、猪、犬、鼠、兔、鸡等气管 －支气管上皮细胞的培养方法［3－6］，而本研究分离培养牦牛的支气管黏膜上皮细胞。肖开颜等［7］分离培养了猪气管上皮细胞，为进一步采用组织工程技术构建带有气道上皮的“复合组织工程化气管”奠定基础。孙裴等［8］分离得到的支气管上皮细胞可连续传到第6代，传代细胞活性好，纯度高，可为进一步的支气管上皮细胞永生化研究奠定技术基础。韩石等［9］分离培养兔气管黏膜上皮细胞和骨髓间充质干细胞，从而为进一步研究骨髓间充质干细胞向气管黏膜上皮细胞诱导分化及低免疫原性组织工程气管假体上皮化的研究提供理论基础和技术支持。本试验通过分离培养牦牛支气管黏膜上皮细胞，为建立牦牛支气管黏膜上皮细胞粘附膜模型奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物和组织来源 健康牦牛支气管，由青海裕泰食品有限公司提供。

1.2 主要试剂 0．25%胰蛋白酶－EDTA、L－甲状腺素(T4)，胰岛素-转铁因子-硒补充剂(ITS)、DMEM/F12培养基、L－谷氨酰胺，牛垂体提取物(BP)，胎牛血清等试剂，购自兰州励合生物有限公司;PCK/CK-18、SABC-FITC，购自武汉博士德生物制剂公司;H.E.染色试剂盒(Solarbio)。

1.3 主要仪器 400目铁网滤筛、6孔细胞培养(Costar);台式高速冷冻离心机(Neofuge－23R，上海力申科学仪器有限公司);超净工作台(HFsafe－1200，上海力申科学仪器有限公司);CO2培养箱(HERACELL 150，Thermo)倒置荧光显微镜(Aol，德国Olympus公司);细胞培养瓶。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养液配制 将DMEM培养基粉末倒入1 000 mL烧杯，无菌水冲洗包装袋内侧，1．2 g NaHCO3再分别加入10μg/mL ITS(胰岛素-转铁因子-硒补充剂)、20 ng/mL L－甲状腺素T4、100 IU/ mL青霉素、100μg/mL链霉素。10 IU/mL庆大霉素，5%～10%的胎牛血清。加无菌水定容到1 000 mL，分装放－4℃冰箱备用。

1.4.2 细胞培养

1.4.2.1 贴壁培养 在超净工作台中取出支气管，小心剥离气管的筋膜和脂肪组织，剪取一块支气管放入平皿内，超纯水漂洗3次、高压水漂洗1～2次、PBS漂洗3次，加2 mL PBS剪碎(大约2 000～5 000下，15 min左右)，尽可能剪碎的组织再用PBS漂洗3次，再用含有5%～10%胎牛血清的DMEM培养液洗3次。吸取组织块连DMEM培养液一起倒入细胞培养瓶，画“之”字形分两瓶，放置5～10 min，在超净工作台中倒置培养瓶拧紧瓶盖放置2～4 h。然后分别加入5 mL DMEM完全培养液，平拿转移到CO2培养箱。

贴壁培养还可以用另一种方法:之前步骤和上述一样，在转移到培养瓶之前，加入2 mL胰蛋白酶消化5 min后加2 mL含有10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化。1 000 r/min(8℃)离心5 min，弃上清，加5 mL培养液吹打混匀“之”字形分装到两个细胞培养瓶中，平拿转移到CO2培养箱。

1.4.2.2 支气管结扎灌注酶冷消化法 此方法参考王津津［10］的方法，具体操作步骤如下:取出用0.85%生理盐水浸泡的支气管，超纯水漂洗3次、高压水漂洗1～2次、PBS漂洗3次，结扎支气管一端，注入0．25%胰蛋白酶，然后结扎支气管的另一端，用PBS浸泡结扎好的支气管放－4℃冰箱24 h后，在超净工作台中，取出消化的支气管，吸取消化液400目网筛过滤，收集滤液加入完全培养液终止消化，1 000 r/min(4℃)离心10 min，弃上清，加入完全培养液再离心，重复两次，洗去胰蛋白酶。离心好后弃上清再加完全培养液分装到两个细胞培养瓶中，放置10 min，平拿转移到CO2培养箱。

1.4.3 上皮细胞鉴定

1.4.3.1 H.E.染色 参考韩石［9］的方法，具体操作步骤如下:

细胞爬片的制备:将盖玻片置于浓硫酸中浸泡过夜，第2天先用自来水冲洗干净，再置于无水乙醇中浸泡6 h，再用蒸馏水冲洗干净，放在饭盒烘干后，进行高压消毒，高压后放入烤箱中烤干;用0.25%胰蛋白酶消化贴壁的细胞，5 min内等细胞从瓶壁脱落，加入(含10%胎牛血清)完全培养液终止消化，然后1 500 r/min(4℃)离心5 min后弃上清，再加5 mL完全培养液重复离心，收集细胞沉淀，再加入适量完全培养液，吹打混匀，使细胞完全悬浮;先在6孔培养板每孔滴少量完全培养液，再将高压烘干后的玻片放入6孔培养板中，然后将细胞悬液直接滴在玻片上，放37℃，CO2培养箱中培养。

样品固定:取出细胞爬片，用PBS洗涤3次。4%多聚甲醛固定30 min;苏木素染色2～3 min，蒸馏水冲洗;95%乙醇30 s;伊红染液染色1 min，蒸馏水洗涤，室温自然晾干细胞爬片后，中性树胶封片，高倍显微镜观察。

1.4.3.2 扫描电镜 参考韩石［9］的方法，具体操作步骤如下:对上述方法培养的第2代气管黏膜上皮细胞常规爬片，2．5%中性戊二醛磷酸缓冲液固定，在4℃条件下保存;室温条件下用0．1MPBS缓冲液清洗样品15 min，重复3次;依次在50%，70%，80%，90%，95%，100%梯度酒精脱水，每一浓度15 min;室温条件下，先浸入乙酸异戊酯和丙酮混合溶液(体积比1∶1)30 min，再浸入纯乙酸异戊酯置换约30 min;临界点干燥仪对样品干燥3 h;采用SCD500型离子溅射镀膜仪对样品进行导电处理;粘贴到样品板上进行扫描电镜观察。

2.2 两组hs-CRP与血嗜酸粒细胞水平比较 治疗后，两组患者hs-CRP与血嗜酸粒细胞水平较治疗前明显降低，且B组均低于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

1.4.3.3 免疫荧光鉴定 对上述方法培养的第二代气管黏膜上皮细胞常规爬片，4%多聚甲酸固定60～90 min;0．5%Triton X-l00 37℃穿孔20 min，PBS漂洗5 min 2次;滴加1%BSA，37℃封闭30 min，甩去多余液体，不洗:滴加1%BSA 1∶32稀释的一抗(PCK/CK-18)，37℃2 h，PBS漂洗5 min 2次;滴加1%BSA 1∶64稀释的二抗(生物素化山羊抗小鼠IgG)，37℃1 h，PBS漂洗5 min 2次;滴加1% BSA 1∶64稀释的SABC-FITC，37℃0．5 h，PBS漂洗5 min 2次;留少量PBS，观片。空白对照组采用PBS代替一抗。

1.4.4 细胞传代

1.4.4.1 原代细胞铺满细胞培养瓶80%时，把细胞培养瓶中的培养液吸净，用无菌的PBS冲洗培养瓶，洗去残留的培养液。

1.4.4.2 用0．25%胰酶消化细胞，显微镜下观察细胞由梭形成圆形。加入完全培养液终止消化，反复吹打使细胞尽量从瓶底分离，1 500 r/min(4℃)离心5 min，弃上清液，加入少量培养液，反复吹打，使上皮细胞重悬。

1.4.4.3 再加少量培养液反复吹打使细胞再次悬浮，1 500 r/min(4℃)离心5 min，弃上清液(此过程反复2次，为洗去残留的胰蛋白酶)。

1.4.4.4 吹打混匀后重悬液转至1次性培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中培养细胞。按1∶2比例传代。

1.4.5 细胞冻存 冻存液配制:70%完全培养液加20%胎牛血清加10%DMSO(DMSO要慢慢滴加，边滴边摇)冻存液常用DMSO(二甲基亚砜)作为冻存保护剂［11－14］。

取对数生长期的细胞，用0．25%胰蛋白酶消化，消化液1 000 r/min(4℃)离心5 min，弃上清加入配制好的冻存液，吹打混匀分装到冻存管中，每管1～1．5 mL(调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/mL～1×107/mL)。在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。

1.4.6 细胞复苏 从液氮罐中取出冷冻管。迅速放入37℃水浴中，并不时摇动，在1 min内使其完全融化。1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入适量培养液，接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换1次培养液，继续培养，观察生长情况。

2 结果与分析

2.1 原代牦牛支气管黏膜上皮细胞培养分析 采用倒置显微镜观察细胞生长情况，培养12～24 h后大量上皮细胞贴壁，呈圆形或梭形，部分上皮细胞漂浮于培养液中，每2 d换1次液，约6～8 d上皮细胞长满瓶底，形态呈扁平不规则状，周围轮廓清晰，呈铺路石样(100×)(见中插彩版图1－A、B)。

2.2 传代牦牛支气管黏膜上皮细胞培养分析 传代后的细胞比原代细胞生长速度快，贴壁时间短(100×)(见中插彩版图1－C)。

2.3 支气管上皮细胞的鉴定

2.3.1 H.E.染色 上皮细胞的鉴定采用H.E.染色的方法，即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别于细胞核和细胞质发生作用，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折光率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像。贴壁培养第二代细胞经H.E.染色的效果图，可见细胞形态呈梭形、圆形、多角形等，细胞核深染，细胞质淡红色(200×)(见中插彩版图1－D)。

2.3.2 扫描电镜和免疫荧光 部分细胞可见纤毛。(见中插彩版图1－E)，免疫突光(FITC－PCK/CK－18)显示细胞密集排列，细胞核清晰可见，细胞质呈亮绿色 集排列，细胞核清晰可见，细胞质呈亮绿色(200×)(见中插彩版图1－F)。

3 讨论

3.1 本试验使用两种方法分离了牦牛支气管黏膜上皮细胞，分别为支气管结扎灌注酶冷消化法和支气管组织贴壁法。王津津等［10］人研究了支气管结扎灌注酶冷消化的方法分离细胞，为了提高细胞的活力和数量，消化的时间是至关重要的，消化时间长的话，细胞越容易分离，但消化过长，细胞活力下降，是因为细胞和酶液作用时间太长，所以一般消化时间为15～18 h，即可终止消化。收集的细胞悬液中的组织块可能会影响细胞的贴壁，可采取400目网筛过滤的方法，去除组织块。组织贴壁培养的方法，操作简单，费用较低，即可以减少细胞的流失，又可以减少被真菌污染;并且在细胞的剪切过程中，会出现游离的单个细胞，这些可以生长增殖［15］，可牦牛支气管组织比较硬，剪切时难剪碎，从而剪碎组织的大小直接决定组织块的贴壁，因此细胞生长较慢，相比之下，支气管结扎灌注冷酶消化的方法更适合牦牛支气管黏膜上皮细胞的培养。

3.2 本试验用H.E.染色的方法来鉴定牦牛支气管黏膜上皮细胞，该染色过程从化学反应看，组织细胞内含有酸性物质和碱性物质，细胞的酸性物质与碱性染料的阳离子结合，而细胞核的碱性物质与酸性染料的阴离子结合，使其中酸性细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，而碱性的胞浆被酸性染料伊红染成红色。其结果细胞核呈蓝色，胞浆呈红色。从物理学现象看，主要有吸附，吸收之说，H.E.染色提供良好的核浆对比染色，是细胞化学染色最常用的一种方法。

3.3 有报道［16］称可以用较便宜的胰蛋白酶可以替代链酶蛋白酶，来进行细胞的消化。动物细胞表面很多和细胞培养瓶结合的蛋白质都是带有钙或镁离子的蛋白质，EDTA对钙镁离子有很好的螯合作用，可以更好的辅助胰蛋白酶降解相应蛋白质，在消化效率上，会有很大的提高，所以本研究选用0．25%胰蛋白酶—EDTA。至今无血清培养技术变得日益成熟［17－19］，但本研究用(含5% ～10%胎牛血清)DMEM培养液来进行牦牛支气管上皮细胞的分离培养，发现加入的血清浓度和时间对上皮细胞的培养有很大的影响，还有胰岛素－转铁因子-硒补充剂在上皮细胞的培养中不可或缺。至于通过400目网筛过滤细胞消化液，是为了保证支气管上皮细胞的纯度和活性，可以过滤多余的组织和成纤维细胞，用胰蛋白酶消化的细胞消化液离心时，用培养液反复冲洗两次，目的是为了洗去残留的胰蛋白酶，保证细胞更好的生长。

［1］ 高元妹，张平，夏旸，等．人支气管上皮细胞原代培养方法的对比研究［J］．实用医学杂志，2011，15:2 698-2 700．

［2］ 甘露，张志辉，吕美娜，等．细胞培养技术［J］．中国组织工程研究与临床康复，2008，29:5 739-5 742．

［3］ Lam H C，Choi A M，Ryter S W．Isolation ofmouse respiratory epithelialcells and exposure to experimentalcigarette smoke atair liquid interface［J］．J Vis Exp:JoVE，2011(48):2 513-2 517．

［4］ Nollevaux G，Deville C，E I Moualij B，et al．Development ofa serum-free co-culture ofhuman intestinalepithelium cell-lines(Caco-2/HT29-5M21)［J］．BMC Cell Biol，2006，7(1):20-31．

［5］ 孙裴，张彦明，张浩，等．鸡气管上皮细胞分离培养及传支病毒在其培养特性研究［J］．中国农业科学，2008，41(3): 861-867．

［6］ Hawkins E C，Birkenheuer A J，Marr H S，et al．Quantification of mucin gene expression in tracheobronchial epithelium of healthy dogs and with chronic bronchitis［J］．Am J Vet Res，2007，68(3): 435-440．

［7］ 肖开颜，周广东，刘伟，等．猪气管上皮细胞的分离、培养和鉴定［J］．中华胸心血管外科杂志，2006，05:326-328．

［8］ 孙裴，张彦明，杨小云，等．猪支气管黏膜上皮细胞的分离培养和传代研究［J］．畜牧兽医学报，2008，39(6):771-777．

［9］ 韩石．兔气管黏膜上皮细胞和骨髓间充质干细胞的体外培养与鉴定［D］．扬州:扬州大学，2012．

［10］ 王津津，张彦明，汤智慧，等．副猪嗜血杆菌对猪气管上皮细胞的黏附作用及其黏附模型的建立［J］．西北农业学报，2010，19(6):23-28．

［11］ Ostrowska A，Bode D C，Pruss J，et al．Investigation of functional and morphological integrity of freshly isolated and cryopreserved human hepatocytes［J］．Cell Tissue Bank，2000，1(1):55-68．

［12］ Tan C，Hu S，Liu J，etal．Synthesis，characterization，antiproliferative and anti－metastatic properties of two ruthenium—DMSO complexes containing 2，2'-biimidazole［J］．Eur J Med Chem，2011，46(5):1 555-1 563．

［13］ Amelio ND，Aroulmoji V，Toraldo A，et al．Aggregation properties and structural studies of anticancer drug Irinotecan in DMSO solution based on NMR measurements［J］．Journal of Molecular Structure，2012，1013:26-35．

［14］ Hanslick J L，Lau K，Noguchi K K，et al．Dimethyl sulfoxide (DMSO)produces widespread apoptosis in the developing central nervous system［J］．Neurobiol Dis，2009，34(1):1-10．

［15］ 李伟，李裕强，孙春龙，等．组织块贴附法原代培养小鼠皮肤细胞方法的改进［J］．江苏农业科学，2009，37(3):30-31．

［16］ 邓三明，汪健，连耀国，等．四种气管上皮细胞分离培养方法的比较研究［J］．医学研究生学报，2005，18(10):870-874．

［17］ Jefferson D M，Cobb M H，Gennaro J F，et al．Transporting renal epithelium:culture in hormo－nally defined serum－free medium［J］．Science，1980，210:912-914．

［18］ Nollevaux G，Deville C，Moualij B E，et al．Development of a serum-free co－culture of human intestinal epithelium cell－lines［J］．BMC Cell Biol，2006，7:20．

［19］ Moll R，Franke W W，Platzer B V，et al．Different keratin polypeptides in epidermis and other epithelia ofhuman skin:a specific cytokeratin of mo-lecular weight 46000 in epithelia of the pilosebaceous tract and basal cell epitheliomas［J］．J Cell Biol，1982，95:285．

Isolation，culture and identification of yakbronchial epithelial cells

LEI Sheng-yan1，WANG Guang-hua2，MA Li-qing2，SHAO Fang-hong3，ZHANG Hong-jian1，ZHAO Jing1

(1．Qinghai University of Agriculture and Animal Husbandry，Xining 810016，China;2．Qing hai Livestock Farming Vet Academy of Sciences，Xining 810016，China;3．Ecological environment of Engineering college，Qinghai University，Xining 810016，China)

In order to isolate and culture the bronchial epithelialcells of yak，the bronchial mucosal epithelial cells wereisolated and cultured by the method of bronchial ligation and cold digestion and bronchial tissue adherence．The second generation cells were observed by H．E．staining，and the morphology and structure of cultured epithelial cells were identified by scanning electron microscopy and immunofluorescence，results show that the two methods were used to obtain the yak bronchial epithelial cells，which with high activity and high purity;H．E．staining showed that the cultured cells were spindle shaped，round，polygonal，hyperchromatic nuclei，and cytoplasm pale red．Scanning electron microscopy showed that the cells were clearly visible．Fluorescent identification showed that the nucleus was clearly visible and the nucleus was bright green．The results showed that the cultured cells were epithelial cells．

bronchial epithelial cells;isolation;identification;culture

ZHAO Jing

S823.85

A

0529-6005(2017)06-0039-04

2016-11-15．

国家自然科学基金项目(31560701);教育部国际合作与交流司项目(2016-12);青海省科技厅项目(2016－HZ－823)

雷生妍(1992-)，女，硕士生，研究方向为高原动物畜禽生理学，E-mail:1657628000@qq．com

赵静，E-mail:1974679163@qq．com