乳酸菌噬菌体及其PCR法检测研究进展

朱良工，关松梅，刘海燕，王丹，张筠

（1.黑龙江省绿色食品科学研究院，哈尔滨150028；2.黑龙江东方学院，哈尔滨150086；3.新希望乳业股份有限公司技术中心，成都610016）

乳酸菌噬菌体及其PCR法检测研究进展

朱良工1，关松梅2,3，刘海燕3，王丹1，张筠2

（1.黑龙江省绿色食品科学研究院，哈尔滨150028；2.黑龙江东方学院，哈尔滨150086；3.新希望乳业股份有限公司技术中心，成都610016）

简述了乳酸菌噬菌体以及一些利用PCR技术检测噬菌体的方法，旨在为相关研究人员提供参考，同时以期为乳制品行业开展监测噬菌体污染奠定基础。

乳酸菌；噬菌体；PCR；检测

0 引言

噬菌体无处不在，是当前地球上最主要的生物实体。科学家曾试图利用噬菌体治疗疾病，如痢疾或葡萄球菌感染等。噬菌体的关键角色之一是平衡每个共享环境的细菌数量。但是在乳制品发酵行业中，尤其在干酪生产的过程中，噬菌体是发酵异常的主要原因。

噬菌体污染问题广泛存在于食品、化工、制药、饲料、农药产业，然而乳制品行业可能是感染噬菌体频率最高的行业。在发酵乳与奶酪的生产中，都有噬菌体污染的可能性。统计发现，在奶酪生产中，60%～70%的生产中断是由于噬菌体污染[1]。

在发酵工业中，原料奶一般为巴士杀菌，这提供了噬菌体生存的条件。车间中的设备、空气、地板等都可能存在噬菌体，这是引发噬菌体经常性污染的原因[2]。乳酸菌在感染噬菌体后会延缓发酵甚至停止发酵，给企业造成巨大经济损失。本文介绍了乳酸菌噬菌体，同时总结了目前的一些乳酸菌噬菌体的检测方法。

1 乳酸菌及噬菌体简介

1.1 乳酸菌

乳酸菌是真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科，能发酵碳水化合物产生乳酸，是一类无芽孢、不运动或很少运动的革兰氏阳性菌总称，按其细胞形状可分为两类，一类为呈球状的链球菌族，一类为呈杆状的乳酸杆菌族[3]。链球菌族分为五个属，分别为双球菌属(Diplococ-cus)；链球菌属(Streptococcus)；足球菌属(Pe⁃dio-coccus)；明串珠菌属(Leucomostoc)；消化链球菌属(Peptostreptococcus)，对发酵行业最为重要的是链球菌属。乳酸杆菌族分为五个属：乳酸杆菌属(Lactobacil⁃lus)；真细菌属(Eubacterium)；链条杆菌属(Catenabacteri⁃um)；假枝杆菌属(Ramibacterium)；运动杆菌属(Cillobacte⁃rium)[3]。其中，乳酸杆菌属在发酵行业中应用最为广泛。乳酸菌发酵根据其发酵产物可分为两种类型，一种为同型乳酸发酵，代谢产物只有乳酸，另一种为异型乳酸发酵，代谢产物除乳酸外还可产生甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、醋酸、乙醇、二氧化碳和甘露醇等[4]，赋予发酵产品甜、香、维生素、胞外多糖和细菌素等使其具有健康和安全的特性[5]。近年来保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌经常用于乳酸菌发酵剂的使用。

1.2 噬菌体

噬菌体能侵染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物细胞，是一类主要由核酸和蛋白质组成的病毒，噬菌体的遗传物质是核酸，为DNA或RNA[6]，多为DNA，衣壳和尾部由蛋白质构成。噬菌体有两种类型，一种为烈性噬菌体，另一种为温和噬菌体，烈性噬菌体可导致宿主菌裂解。

在1896年英国科学家Ernest Hankin初次提出了微生物中存在某种抗菌活性物质的现象。1898年，Niko⁃lay Gamaleya在枯草芽孢杆菌中发现了类似现象[7]。

英国科学家Frederick wort在1915年培养金黄色葡萄球菌的过程中，第一次发现菌落上出现透明斑，并将该现象解释为病毒感染[8]。1917年，巴黎巴斯德研究所的法裔加拿大微生物学家Felix d’Herelle将这些抗菌活性物质解释为由寄生在细菌中的病毒所引起,并正式命名为“噬菌体”[9]。1944年Baylor等[10]利用电子显微镜观察噬菌体，为噬菌体的研究奠定了基础。

1.3 乳酸菌噬菌体

20世纪30年代首次报道了感染噬菌体会影响牛乳发酵，这给乳品发酵行业带来了巨大的经济损失。乳酸菌在被噬菌体侵染后，其菌株的产酸能力和蛋白水解能力减弱而导致产酸下降，延缓发酵甚至终止发酵，使乳制品质量（例如，营养价值、味道、质地等等）下降[11-12]。乳酸菌类型复杂，致使乳酸菌噬菌体种类繁多。

1.3.1 乳酸菌噬菌体分类

在噬菌体研究初期根据其宿主范围、形态进行和侵染途径进行分类，据其侵染途径可分为烈性噬菌体和温和噬菌体，烈性噬菌体可在短时间内可完成一系列侵染过程实现噬菌体对乳酸菌的裂解增殖，而温和噬菌体在侵入宿主菌后，只将噬菌体DNA整合到宿主菌染色体上，一般不对宿主菌产生裂解作用[5]。乳酸菌噬菌体根据其形态可以分为有尾噬菌体和无尾噬菌体，其中大部分都被归为有尾病毒目，有尾噬菌体又可以分为长尾噬菌体、肌尾噬菌体、短尾噬菌，乳酸菌噬菌体中头等长，具有长而非收缩性的尾是最常见的形态[13]。随着对噬菌体研究的深入，可根据噬菌体的基因相关性和同源性把噬菌体分成12类，在发酵乳制品中分离出的噬菌体大多为长尾噬菌体科的圆头状936型、长头状c2型和圆头状p335型[14-15]。其中936型和c2型具有较强的裂解性和较为广泛的宿主范围。

1.3.2 乳酸菌噬菌体侵染机制

乳酸菌噬菌体作用于乳酸菌的过程较快。如当一个乳酸菌噬菌体感染了一个乳酸菌，经20～40 min后，就能感染15～100个。噬菌体侵染细菌时，通常分为潜伏期和裂殖期，前期表现缓慢。当噬菌体数量少时，对发酵剂无影响，但到达裂殖后，乳酸菌发酵剂中的细菌在短时间内就会被破坏[16]。

乳酸菌被噬菌体侵染的过程可分为四个阶段，首先噬菌体与乳酸菌表面发生非特异性吸附，该过程有可逆性，受外界条件的影响，如pH值和温度；然后噬菌体尾部与细菌表面受体发生特异性共价结合，这一过程不可逆，决定噬菌体宿主的特异性[17]。吸附结束后，经过挤压将DNA注入宿主细胞，其外壳多留在细菌表面。在噬菌体DNA进入宿主细胞后，DNA通过控制宿主细胞基因的复制而转录噬菌体基因，并翻译噬菌体蛋白，使子代噬菌体装配完整。在宿主细胞完成大量子代噬菌体装配后，噬菌体产生的溶菌素酶溶解细胞，从而释放噬菌体。

1.3.3 乳酸菌噬菌体基因组概况

由于噬菌体基因组小，较易测序，在基因组测序中表明，大多数噬菌体含有前噬菌体，噬菌体基因组学对研究抗噬菌体菌株以及噬菌体检测都具有重要意义，基因组序列信息逐年呈上升趋势。乳球菌噬菌体全基因组序列占已知乳酸菌噬菌体序列较大部分，目前已公布于GenBank中的乳酸菌噬菌体基因组共131个，其中34个乳杆菌噬菌体基因组，87个乳球菌噬菌体基因组，10个前噬菌体[1]。乳酸菌噬菌体均为有尾双链DNA噬菌体，基因组大小在18～55 kb之间，鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的比例从37%～48%，与宿主基因组相当。嗜热链球菌噬菌体都是长尾噬菌体，且所有已知的嗜热链球菌具有DNA同源性，而乳杆菌噬菌体全基因序列研究较少，已知噬菌体基因组均为双链线性DNA分子。

2 PCR方法检测乳酸菌噬菌体

西班牙、阿根廷、白俄罗斯等国家都对重要的乳制品菌株的噬菌体进行了研究[10,18-19]。在这些研究中，主要研究了乳球菌、乳杆菌噬菌体的应用过程。目前检测乳酸菌噬菌体的方法多使用双层琼脂平板法和通量血细胞计数[13,20-21]。双层琼脂平板法原理是使单个噬菌体侵入处于生长繁殖阶段宿主细胞,经过若干代生长繁殖后才能形成肉眼能判断的溶菌斑，同溶菌斑周围的宿主细胞也要经若干代生长繁殖才能显出较高密度把溶菌斑衬托出来，这个过程需要8～12 h以上。此种方法操作简单，但是需要使用相应的敏感菌株，在噬菌体感染初期无法显示噬菌斑，并且所需时间较长。通量血细胞计数法操作简单，但是结果不够准确，且耗时较长。

聚合酶链式反应是一种在生物体外用于特殊DNA复制的分子生物学技术，可以放大并扩增特定DNA片段。PCR方法主要是能够使微量DNA大幅扩增。美国Mullis在1983年最初提出假想，在1985年完成了聚合酶链反应的发明，这标志着PCR技术的诞生。如今，PCR已发展到第三代技术。台籍科学家钱嘉韵在1973年发现了稳定的Taq DNA聚合酶，将PCR技术的基础性研究带到了一个新的高度。DNA提取的质量和浓度是PCR检测的关键，提取方法是实验能否成功的一个关键性因素[22]。目前，PCR方法已成功应用于噬菌体的检测。

2.1 普通PCR

2006年，廖威等使用PCR方法检测苏云金杆菌的溶原性噬菌体根据苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis, B.t)溶原性噬菌体GIL01(GenBank Accession Number: AJ536703)的同源序列设计出一对引物，将35株生产菌株MZ1(血清型H3a3b)和B.t标准菌株活化后作模板，其中16株菌株包括MZ1扩增出约750 bp的预期产物[23]，通过噬菌斑实验，证明这16株菌株中的生产菌株MZ1为溶原菌噬菌体。从而证明PCR方法鉴定苏云金杆菌溶原性的可行性。

通过对指示菌法、直接电镜法和DNA鉴定法的比较，证明PCR方法检测噬菌体灵敏度更高，且快速简洁。目前，利用PCR方法已经成功检出牛奶或乳清中的乳球菌属、乳杆菌属、链球菌属噬菌体，最低检出限为103PFU/mL，普通PCR方法检出限为104～107PFU/mL[24-29]。

目前选育的乳酸菌益生菌菌株种类繁多，益生菌逐渐受到大众的喜爱和认可，但是这种益生菌菌株较普通菌株感染噬菌体的风险大大增加，这严重影响了益生菌酸奶的生产[30]。尤其是烈性噬菌体的存在，可以快速裂解益生菌菌株，所以，PCR方法以其快速准确的特点而成功应用于益生菌菌株噬菌体的检测。AnaG.Binetti等利用聚合酶链式反应即PCR方法检测干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌噬菌体[31]。在基因数据库中只有φA2和φAT3的全基因序列，所以选取特异性基因片段设计引物。该方法的最低检测限位104PFU/mL，可以检测原料乳、发酵乳以及奶酪乳清中干酪和副干酪菌株噬菌体的存在。这种方法可以用于工业生产中的批量检测，在污染初期即可以检测到噬菌体的存在，对益生菌发酵行业有意义。

2.2 RT-PCR

病毒的核酸多为RNA，噬菌体是病毒的一种，利用PCR技术检测遗传物质为RNA的病原体，需要将RNA反转录成cDNA，再以此为模板进行扩增，即RT-PCR[32]。代小英等比较了实时荧光RT-PCR和普通RT-PCR检测噬菌体MS2的差异[33]，将噬菌体MS2复制酶基因和衣壳蛋白基因利用实时荧光一步RT-PCR法和普通的两步RT-PCR法分别进行检测，从而对两种方法的检测灵敏度和特异性进行比较。结果表明，普通的两步RT-PCR法特异性强于荧光一步RT-PCR法，但后者的灵敏度比前者高104倍。RT-PCR应用于RNA类型的病毒检测，该方法灵敏度高，特异性强。由于大部分乳酸菌噬菌体遗传物质为DNA，所以PT-PCR应用到乳酸菌噬菌体的检测尚未见报道。

2.3 荧光定量PCR

Daniel C.Edelman利用荧光定量PCR检测和量化在溶菌产物DNA纯化之前的噬菌体[34-36]。首先在噬菌体下面发现了一个点状单元，检测纯化DNA样本，至少有89种病毒。使用荧光定量PCR对未知浓度的噬菌体制剂进行评估，灵敏度和精密度大大提高。Mai Huong在2011年利用荧光定量PCR的方法定量检测乳清中的噬菌体c2,936和P335[37]。采集法国三个农场的山羊奶样本，在普通PCR的基础上将各项反应条件进行优化。实时定量PCR的一个难点是原料乳中DNA提取的优化，需提取出最大量病毒基因组和消除压抑PCR反应，引物PCR条件的选择也很重要。使用非特异性绿色荧光染料SYBR直接检测和量化三组噬菌体。设计特异性引物，然后建立荧光PCR标准曲线，定量测定样品中的噬菌体浓度，得出的Ct值对应于标准曲线[38]。该方法可以对乳酸菌噬菌体进行定量检测，从而可以更有效的杀灭噬菌体，但是该方法成本较高，需要专业的操作人员，不能区分噬菌体是否灭活，难以应用于实际生产中的检测，可将传统方法与该方法结合，从而降低成本，并达到定量检测的要求。

2.4 多重PCR

多重PCR的原理是同时将多对特异性引物加入反应体系中，同时扩增出多条大小存在明显差异的目的DNA片段，根据产物的片段大小或利用分子杂交实现多病原的同时检测[39]。

S Labrie在2000年利用多重PCR检测乳酸菌噬菌体936、c2和P33，在一个反应中选取三段特异性片段，分别设计引物[40]。BD Rio在2007年利用多重PCR监测发酵乳生产过程，检测德式乳杆菌噬菌体3种、乳链球菌噬菌体和乳酸菌噬菌体，用噬菌体基因组序列和守恒的区域来设计五对引物[41]，分别对应上面的噬菌体，引物设计生成特定片段的大小取决于基因的特异性。该方法可以检测到在未经发酵牛奶中的噬菌体，根据所设计的引物可以检测多个噬菌体，是PCR方法应用于噬菌体检测的一大进步。

3 结论

迄今为止，在乳制品行业中，噬菌体感染乳酸菌仍然是一个严重的问题，相关人员一直在竭尽所能的进行防治、检测和治理噬菌体污染问题，已经取得一定的成果，但是仍然有噬菌体污染情况偶有发生，尤其是我国无论是生产环境还是检测方法都较国外存在一定差距。目前，我国检测噬菌体的方法大多停留在传统噬菌斑法，检测时间较长，而分子生物学方法检测时间短，效率高，是噬菌体检测行业的福音，但是该方法成本相对较高，并不适用于工厂中的批量检测，如何降低检测成本，使之适合于实际生产中的检测，是接下来的研究重点。

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Research progress on Lactic acid bacteria phage and its PCR detection

ZHU Lianggong1,GUAN Songmei2,3,LIU Haiyan3,WANG Dan1,ZHANG Yun2
（1.Green Food Science Research Institute of Heilongjiang,Harbin 150028,China;2.East College of Heilongjiang Har⁃bin 150086,China;3.Technology Center,New Hope Dairy Co.,Ltd.,Chengdu 610016)

This paper describes some methods of detecting phage using PCR technology,which aims to provide reference for relevant re⁃searchers and lay the foundation for monitoring phage pollution in dairy industry.

Lactic acid bacteria;phage;molecular biology;detection

TS252.7

：B

：1001-2230（2017）06-0035-04

2016-12-24

朱良工(1961-),男,研究员级高级工程师,从事乳品加工方面的研究。

张筠