唾液酸受体在家禽肾和生殖系统组织中的表达

李颖鑫 ， 霍彩云 ， 肖 凯 ， 倪子欣 ， 唐玉玲 ， 王昭华 ， 胡艳欣

(中国农业大学动物医学院 ， 北京海淀100193)

唾液酸受体在家禽肾和生殖系统组织中的表达

李颖鑫 ， 霍彩云 ， 肖 凯 ， 倪子欣 ， 唐玉玲 ， 王昭华 ， 胡艳欣

(中国农业大学动物医学院 ， 北京海淀100193)

为了观察流感病毒唾液酸α2,3-半乳糖和唾液酸α2,6-半乳糖两种受体在鸡、鸭两种家禽肾脏和生殖系统组织中分布和表达的特征, 本研究利用凝集素免疫荧光组织染色方法对各器官组织进行了系统的定性分析。结果显示，唾液酸α2,3-半乳糖和唾液酸α2,6-半乳糖这两种受体在鸡、鸭肾脏和生殖系统中皆有分布，其中唾液酸α2,3-半乳糖的分布更为广泛。这一研究结果提示，鸡、鸭肾脏和生殖系统组织细胞对禽流感病毒和人流感病毒都存在易感的基础，且更容易感染禽源的流感病毒。

流感病毒 ； 唾液酸受体 ； 肾 ； 生殖系统 ； 凝集素 ； 免疫荧光

流感病毒属于正黏病毒科，流感病毒属，是有囊膜的RNA病毒，根据其内部核蛋白(nucleoprotein, NP)和基质蛋白(matrix protein, M)抗原性的不同，可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。流感病毒可引起人、禽、猪、马、蝙蝠等多种动物感染和发病，是人流感、禽流感、猪流感、马流感等人与动物疫病的病原。这些疫病典型的临床症状是急性高热、全身疼痛、显著乏力和呼吸道症状。流行性感冒(influenza, flu)在世界各地常会有周期性的大流行，病毒的快速传播以及较高的发病率和致死率给人类和动物的健康造成了巨大的威胁。除了世界性大流行外，每年的季节性流行性感冒也造成了大量的发病率和死亡率。

流感病毒感染宿主的第一步是病毒表面HA 识别宿主细胞表面的受体并与其结合[1]。流感病毒的受体为含唾液酸(sialic acid, SA)的糖链，对病毒的宿主特异性和组织嗜性起到重要的决定性作用[2]。SA 广泛存在于生物体内，常以高伸缩状态通过糖苷键(α2,3、α2,6 或 α2,8)连接于糖链末端[3]。不同物种、不同器官、不同细胞表面的唾液酸分子类型及糖苷键类型不尽相同。目前被普遍接受的流感病毒受体主要有两种，唾液酸α2,3-半乳糖(Galactose, Gal)(SAα2,3Gal)和唾液酸α2,6-半乳糖(SAα2,6Gal)。人流感病毒主要识别末端为α2,6Gal的糖链受体，其主要存在于人类的上呼吸道，而禽流感病毒主要识别末端为α2,3Gal的糖链受体，其广泛存在于人类的下呼吸道及禽类的胃肠道[4]。研究表明，除了糖苷键类型外，宿主体内唾液酸受体的分布、类型、分子构象均是决定流感病毒能否感染的关键因素[5]。这种受体分布不同被认为是流感病毒在禽类和人之间跨种属传递的主要障碍。接骨木凝集素( Sambucus nigra agglutinin，SNA)能够与SAα2,6Gal特异性结合，而山槐凝集素(Maackia amurensis agglutinin, MAA)则能够与SAα2,3Gal特异性结合[6]。

禽或人的呼吸道和消化道各解剖部位流感病毒SA受体分布已被广泛报道，泌尿和生殖系统组织SA的表达和分布鲜有报道。本试验选取鸡、鸭这两种家禽的肾和生殖系统组织，应用免疫荧光染色法检测上述各解剖部位SAα2,3Gal和SAα2,6Gal受体的分布情况，初步探讨鸡、鸭流感病毒SA受体的表达，为进一步了解禽流感宿主噬性研究提供基础数据 。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 140日龄白羽肉鸡(雌雄各1只)，购自中国农业大学动物科技学院牧场。120日龄北京鸭(雌雄各1只)，购自北京宏光鸭场。

1.1.2 试剂 荧光素标记植物凝集素SNA、MAA购自Vector Laboratories公司；抗荧光衰减封片剂(含DAPI)，购自北京索莱宝科技有限公司；进口羊血清工作液，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验取材 颈动脉放血处死鸡、鸭，无菌采集其肾脏及部分生殖系统组织，10%的福尔马林溶液固定24 h后经常规脱水、石蜡包埋后，制备成3 μm厚的切片，用于免疫荧光染色，每个组织取2张切片，分别用于滴加生物素标记的凝集素SNA和MAA。

1.2.2 免疫荧光染色 切片用二甲苯及梯度酒精常规脱蜡水化后，蒸馏水冲洗1次，PBS浸洗3次，每次5 min，滴加进口羊血清工作液，室温避光静置20 min后分别滴加生物素标记的凝集素SNA和MAA，前者特异性标记SAα2,6Gal 受体，后者特异性标记SAα2,3Gal受体，室温避光孵育1h。经PBST洗涤3次，每次5min，再滴加含DAPI的抗荧光衰减封片剂进行封片。

1.2.3 显微镜观察 用荧光显微镜(OLYMPUS TH4-200)观察免疫荧光染色后的各组肾和生殖系统组织切片，出现绿色荧光即为阳性信号。

2 结果

2.1 鸡肾和生殖系统组织流感病毒唾液酸受体的表达 采用免疫荧光染色的方法对鸡肾和生殖系统组织中SA受体的表达进行检测。如中插彩版图1和中插彩版图2所示，雌性和雄性鸡肾小管上皮细胞分布有大量SAα2,3Gal受体和微量的SAα2,6Gal受体。在输卵管黏膜下层、子宫黏膜上皮细胞、睾丸的精原细胞和间质细胞表面均分布有SAα2,3Gal和SAα2,6Gal两种受体。

2.2 鸭肾和生殖系统组织流感病毒唾液酸受体的表达 采用免疫荧光染色的方法对鸭肾和生殖系统组织中SA受体的表达进行检测。如中插彩版图3和中插彩版图4所示，肾小管上皮细胞分布有大量SAα2,3Gal受体，且雌性肾组织中的MAA阳性信号强度显著高于雄性。在卵巢基质、睾丸间质细胞核阴茎海绵体中均有SAα2,3Gal受体的分布，在这些组织中亦可见SAα2,6Gal受体的分布，免疫荧光阳信信号显著弱于SAα2,3Gal受体。与其他的组织不一样的是，输卵管中SAα2,6Gal受体的分布比SAα2,3Gal受体更为广泛。

3 讨论

不同来源的流感病毒与宿主细胞表面受体之间的特异性相互作用被认为是决定流感病毒能否入宿主细胞以及跨种属传播的重要因素之一。基因进化分析表明，历史上几次大流感病毒株部分或全部基因片段来源于禽流感病毒[7]，其中猪在其形成过程中起非常重要的作用。猪气管存在能与禽流感病毒特异性结合的SAα2,3Gal受体,又存在能与人流感病毒结合的SAα2,6Gal受体,禽流感病毒与人流感病毒均可感染猪,易通过基因重组形成新病毒株,并可能跨越种间屏障感染人类,在人类形成大流行的潜能，因此猪被认为是“基因混合器”[8]。

1997年首次报道的H5N1高致病性禽流感病毒在香港直接从鸡传染到人的事实证明了禽流感病毒是可以直接通过鸡感染人类的[9]。流感病毒唾液酸受体结合特异性在流感病毒种属范围限制中起重要作用。近年来，科学家们试图通过对不同组织的唾液酸分布差异性进行研究，期望能够从中找到病毒跨种传播的原因。但是，多数人的研究仅仅停留在了消化道与呼吸道上面，或者只分析了组织中某一种细胞的受体存在情况，导致了组织内唾液酸分布研究缺乏系统性[10]。本试验从流感病毒HA与宿主细胞SA受体特异性结合为切入点，系统地检测鸡、鸭肾脏和生殖系统SAα2,6Gal和SAα2,3Gal受体。试验结果表明，除了被人重视的呼吸道和消化道外，鸡、鸭的肾脏和生殖系统组织中同样含有SAα2,6Gal及SAα2,3Gal受体，这些组织同样不容忽视，而同时含有两种受体，易与禽流感病毒和人流感病毒结合，有利于多种亚型流感病毒的共同感染，也为病毒侵入和基因重组提供了机会。临床症状表明，产蛋鸡感染高致病性禽流感病毒或中低致病性禽流感病毒，均可引起产蛋量下降，产异常蛋增多。本次试验发现 SAα2,3Gal和SAα2,6Gal受体在鸡生殖系统中的存在，通过两种受体在鸡生殖系统中分布的检测，可以发现病毒结合机体的主要部位，为研究母鸡感染禽流感病毒后产蛋异常的机制奠定基础。有试验证明，H9N2 禽流感病毒能通过种蛋-胚体-雏禽途径垂直传播给后代，但是垂直传播过程中的作用机制并没有进行系统的研究[11]，本试验也可作为基础深入探究禽流感病毒垂直传播的机制。

野生水禽(包括鸭)是甲型流感病毒“自然基因库”，同时其在病毒生态学和增殖中起重要作用。野生水禽的甲型流感病毒可偶尔传递到其他禽类和哺乳动物(包括人)，引起严重疾病的暴发[12]。随着养禽业的飞速发展，流感病毒的自然宿主也越来越复杂，禽流感病毒感染水禽的几率增大，病毒经过长期复制后能够发生变异成为感染性的新亚型病毒。所以除了鸡群之外，我们也需要长期监测鸭群中禽流感病毒的流行动态，提前预防禽流感的暴发。

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Expression of sialic acid receptors in poultry kidney and reproductive system

LI Ying-xin , HUO Cai-yun , XIAO Kai , NI Zi-xin , TANG Yu-ling , WANG Zhao-hua , HU Yan-xin

(College of Veterinary Medicine, China Agricultural University,Beijing 100193，China)

In order to observe the distribution and expression of sialic acid receptor for influenza virus in kidney and reproductive system tissues of chickens and ducks，the qualitative analysis of various tissue sections was performed by using lectin histochemistry method. The results showed that the SAα2, 3 Gal and SAα2, 6 Gal receptors could be detected in both kidney and reproductive system of chickens and ducks. And the distribution of SAα2, 3 Gal was more widespread than SAα2, 6. These results suggest that the tissue cells of kidney and reproductive systes of chickens and ducks are susceptible to both avian and human influenza viruses, which seems to be easier to be infected by avian influenza viruses.

influenza virus ; sialic acid receptor ; kidney ; reproductive system ; agglutinin Immunofluorescence

HU Yan-xin

2017-03-28

“十二五”农村领域国家科技计划课题(2015BAD12B01)；中央高校基本科研业务费专项资金资助(2017DY003)

李颖鑫(1995-)，女，本科生，就读于动物医学专业，E-mail：649966729@qq.com

胡艳欣，E-mail：huyxcau@cau.edu.cn

S852.32

A

0529-6005(2017)07-0013-03