洛伐他汀对抗人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞β-淀粉样蛋白的非胆固醇依赖性保护作用*

赵 亮， 官志忠

(1.贵州医科大学 微生物学教研室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学附院 病理科, 贵州 贵阳 550004； 3.贵州医科大学 地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 4.贵州省医学分子生物学重点实验室 贵州医科大学， 贵州 贵阳 550004)



洛伐他汀对抗人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞β-淀粉样蛋白的非胆固醇依赖性保护作用*

赵 亮1,2， 官志忠2,3,4**

(1.贵州医科大学 微生物学教研室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学附院 病理科, 贵州 贵阳 550004； 3.贵州医科大学 地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 4.贵州省医学分子生物学重点实验室 贵州医科大学， 贵州 贵阳 550004)

目的： 观察洛伐他汀对过表达APP670/671的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞活性及β-淀粉样蛋白(Aβ)二聚体合成的影响。方法： 转染并鉴定过表达APP670/671的SH-SY5Y细胞，筛选无细胞毒性、不影响细胞胆固醇水平浓度的洛伐他汀处理SH-SY5Y细胞24 h，采用CCK-8试验检测细胞的存活率，蛋白印迹法检测Aβ二聚体的蛋白表达水平。结果： 过表达APP670/671的SH-SY5Y细胞中APP的蛋白及mRNA表达水平均明显高于野生型细胞；用 0.1 μmol/L的洛伐他汀处理SH-SY5Y细胞，未见明显细胞毒性作用，胆固醇水平亦未见明显改变；0.1 μmol/L洛伐他汀预处理 SH-SY5Y细胞24 h，能提高细胞存活率，减少Aβ二聚体的分泌。结论： 洛伐他汀具有神经保护作用，可能与减少毒性Aβ的合成有关。

洛伐他汀； β-淀粉样蛋白； 淀粉样前体蛋白； 阿尔兹海默病

阿尔兹海默病(alzheimer’s disease，AD)是一种神经退行性疾病，是老年人最常见的痴呆病因[1-2]。近来的研究发现，β-淀粉样蛋白(β-Amyloid peptide，Aβ)单体以及构成老年斑的Aβ纤丝体都不是造成神经毒性的主要Aβ形式，而可溶性寡聚Aβ是产生神经毒性的主要Aβ形式。有研究证实人和转基因小鼠的大脑组织中至少可以产生4种可以改变神经元和认知功能的可溶性Aβ寡聚体分子：二聚体、三聚体、Aβ*56和环状原纤维，对神经元突触产生不同的毒性作用[3]。目前，对于AD的预防和治疗仍缺乏有效的措施。他汀类药物能通过抑制β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase)的活性并减少内源性胆固醇的合成，常用于治疗伴有胆固醇增高的心血管疾病[4]。越来越多的研究显示，他汀类还具有多种生物学效应，对多种神经退行性疾病，例如AD、帕金森氏病、多发性硬化症、脑缺血等，具有潜在的治疗作用[5]。他汀类药物在神经退行性疾病中的作用，是直接与其降胆固醇效应相关、还是有赖于非降胆固醇依赖性的其他多重效应，目前尚未完全明确。本实验将洛伐他汀(Lovastatin)作用于过表达Swedish 670/671变异APP基因的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞(SH-SY5Y/APPSWE细胞)，了解洛伐他汀非胆固醇依赖性抗毒性Aβ的神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

SH-SY5Y细胞获赠于瑞典卡洛琳斯卡大学。主要试剂：洛伐他汀、胆固醇定量试剂盒、Aβ1-42(美国Sigma公司)；细胞计数试剂盒(日本Dojindo公司)； SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术公司)；BCA蛋白定量试剂盒，cDNA合成试剂盒，TRIzol试剂(美国Thermo公司)；NuPAGE Novex 4%～12% Bis-Tris预制胶、MES SDS电泳液(美国Life Technologies公司)；SYBR green master和X-treme GENE 9 DNA转染试剂(瑞典Roche公司)，PVDF膜、ECL试剂盒(德国Merck Millipore公司)。小鼠抗Aβ多克隆抗体6E10(美国Covance公司)，兔抗β-actin抗体(Abmart公司)，抗兔IgG(美国Cell Signaling公司)，抗小鼠IgG(美国Santa Cruze公司)。pcDNA 3.0质粒及携带Swedish 670/671变异APP基因的pcDNA 3.0质粒获赠于瑞典卡洛琳斯卡大学。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y细胞培养及APP(Swedish 670/671)基因转染 参考文献[6]中的方法，将SH-SY5Y细胞接种于DMEM高糖型培养基(含10%胎牛血清、青霉素100 000 U/L和链霉素100 000 U/L)，培养至细胞生长达到80%～90%，按照X-tremeGENE 9 DNA转染试剂说明进行操作，将空载pcDNA 3.0质粒或携带Swedish 670/671变异位点APP基因的pcDNA 3.0质粒转染至SH-SY5Y细胞中，培养72 h后收集转染细胞，以上转染细胞制备每次3份，重复3次。

1.2.2 转染APP(Swedish 670/671)基因的细胞鉴定 (1)APP mRNA表达水平检测，根据APP670/671基因设计并合成扩增引物，上游序列为AAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATC，下游序列为TGGATTTTCGTAGCCGTTCTG，产物大小为235 bp；β-actin引物购自ABI公司，序列号为4352935E，收集SH-SY5Y WT细胞(仅含pcDNA3.0质粒)和SH-SY5Y/APPSWE细胞(含携带human APP670/671 pcDNA3.0质粒)，用TRIzol法提取细胞mRNA，转录成cDNA，以β-actin为内参，用ABI PRISM 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems，美国)进行Real-time PCR反应，检测APP670/671基因的mRNA表达。(2)APP蛋白表达水平检测，收集SH-SY5Y WT细胞和SH-SY5Y/APPSWE细胞，用含有蛋白酶抑制剂苯甲基硫酰氟(PMSF)的裂解液裂解，提取细胞总蛋白，DC蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。选取4%～12%的Bis-Tris预制梯度胶，将等量蛋白与含还原剂的上样缓冲剂混合后，70 ℃加热10 min，加入预制胶的孔中电泳，120 V稳压转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，封闭2 h，小鼠抗Aβ 6E10抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，辣根过氧化酶标记的抗小鼠IgG二抗孵育1 h，用ECL发光试剂观察表达情况。

1.2.3 洛伐他汀处理细胞及指标检测 取鉴定后的SH-SY5Y/APPSWE细胞接种培养24 h后，细胞生长达80%～90%时，去血清培养12 h，加入洛伐他汀(0.01、0.1及1 μmol/L)分别处理24 h，检测细胞毒性及胆固醇水平。为检测洛伐他汀抗A(的神经保护作用，将SH-SY5Y WT细胞和SH-SY5Y/APPSWE细胞分别以相同的浓度(1×109个/L)接种培养，细胞生长至80%～90%，加入洛伐他汀培养24 h后进行检测如下检测。(1)细胞毒性试验，采用CCK-8法检测细胞毒性。取SH-SY5Y细胞以1×104个/孔浓度接种于96孔板中，每个浓度药物处理的细胞设5个复孔，培养至计划时间后，将每孔的原始培养基取出并加入不含血清及药物的纯培养基100 μL，空白对照组加入100 μL无细胞纯培养基，然后每孔中加入CCK-8试剂10 μL ，37 ℃孵育2 h，450 nm波长测定吸光度[7]。(2)胆固醇水平检测，胆固醇浓度测定按照胆固醇定量试剂盒说明进行操作。去除培养基，PBS洗3次后，每孔加入氯仿∶异丙醇∶IGEPAL CA-630(7∶11∶0.1)溶液200 μL，裂解细胞后14 000 g离心10 min，取上层有机相于新管中，50 ℃温箱中空气干燥，真空抽吸30 min，干燥脂质用Cholesterol Assay Buffer进行溶解，震荡混匀，按试剂盒说明加入试剂和样品，同时应用胆固醇标准品绘制标准曲线，按50 μL/孔将反应混合物加入96孔板，混匀后37 ℃避光孵育1 h，570 nm波长处测量吸光度值。计算胆固醇浓度(C)：C=Sa/Sv，[Sa为根据标准曲线计算的样品胆固醇含量(μg)，Sv为每孔加样体积(μL)]。(3)蛋白印迹法检测Aβ水平，收集细胞培养基，15 000 g冷冻离心15 min，用western blotting方法(见1.2.2)检测培养基中Aβ蛋白表达水平。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 SH-SY5Y/APPSWE细胞鉴定

转染APP(Swedish 670/671)基因的SH-SY5Y细胞，APP蛋白表达量较对照组转染空载pcDNA3质粒的细胞明显增高(P<0.01)，见图1A。SH-SY5Y/APPSWE细胞APP mRNA表达量较对照组转染空载pcDNA3质粒的细胞明显增高(P<0.01)，见图1B。

注：A为APP mRNA表达；B为APP蛋白表达；(1)与Con组比较，P<0.01图1 SH-SY5Y/APPSWE细胞APP mRNA 及蛋白表达水平Fig.1 The mRNA and protein levels of APP in the SH-SY5Y/APPSWE cells

2.2 洛伐他汀细胞毒性试验

CCK-8试验结果显示(图2)，1 μmol/L洛伐他汀作用24 h，可见SH-SY5Y/APPSWE细胞存活率分别下降50%，与未加药组(Con)相比，具有显著差异(P<0.01)，所以在后面的研究中，选择0.01和0.1 μmol/L浓度的洛伐他汀。

注：(1)与Con组比较， P<0.01图2 洛伐他汀细胞毒性试验Fig.2 Cytotoxicity of lovastatin in the SH-SY5Y/APPSWE cells

2.3 洛伐他汀对胆固醇水平的影响

0.01、0.1、1 μmol/L洛伐他汀处理神经细胞24 h，可见1 μmol/L洛伐他汀使神经细胞胆固醇水平明显下降(图3)，与对照组相比，具有统计学意义(P<0.05)。

注：(1)与Con组比较， P<0.05图3 洛伐他汀对SH-SY5Y/APPSWE细胞胆固醇水平的影响Fig.3 Effect of lovastatin on cell cholesterol level in the SH-SY5Y/APPSWE cells

2.4 洛伐他汀对SH-SY5Y/APPSWE细胞活性的影响

CCK-8试验结果显示， SH-SY5Y/APPSWE细胞去血清培养48 h，细胞存活率较SH-SY5Y/WT细胞显著降低(43%)，具有统计学意义(P<0.01)。在培养基中加入0.1 μmol/L洛伐他汀可提高SH-SY5Y/APPSWE细胞的存活率，与对照组相比，具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

注：WT为SH-SY5Y/WT细胞，APPSWE为SH-SY5Y/APPSWE细胞，Lov为洛伐他汀；(1)与[WT]组比较，P<0.05;(2)与[APPSWE]组比较，P<0.05图4 SH-SY5Y/APPSWE细胞洛伐他汀抗 Aβ细胞活性试验Fig.4 Experiment of anti-Aβ by lovastatin in SH-SY5Y/APPSWE and SH-SY5Y/WT cells

2.5 洛伐他汀对Aβ二聚体蛋白水平的影响

去血清培养细胞48 h，可见SH-SY5Y/APPSWE细胞与SH-SY5Y/WT细胞比较，Aβ二聚体蛋白水平明显升高(P<0.05)；而在培养基中加入0.1 μmol/L洛伐他汀共同培养，可降低SH-SY5Y/APPSWE细胞产生的Aβ二聚体蛋白水平(图5)，与未用洛伐他汀处理的SH-SY5Y/APPSWE细胞比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。

注：WT为SH-SY5Y/WT细胞，APPSWE为SH-SY5Y/APPSWE细胞，Lov为洛伐他汀；(1)与[WT]组比较，P<0.05;(2)与[APPSWE]组比较，P<0.05图5 SH-SY5Y/APPSWE细胞Aβ二聚体蛋白水平Fig.5 The protein level of Aβ dimer in SH-SY5Y/ APPSWE and SH-SY5Y/WT cells

3 讨论

随着AD发病率的不断增高，给病人、家庭乃至整个社会带来了越来越沉重的负担，据世界卫生组织统计，全球AD患者共有3 600万，预计至2030年，该数值将翻倍，至2050年，AD患者将达到1亿[8]。为了应对这种日渐严峻的状况，急需寻找有效的干扰措施来阻止或推迟AD的发病、延缓AD病程、改善AD症状，然而自2004年来，并没有新的抗AD药物得到上市的批准[9]。“老药新用”的方法已经成为众多抗AD药物开发的首选[10]。

近期的研究报道显示他汀类药物的应用能降低61%的AD死亡率[11]。除了降胆固醇作用以外，他汀类药物还能产生多种胆固醇非依赖性作用，影响多个重要的生理过程，例如，调节内皮细胞功能、抗炎症反应、抗氧化应激、影响细胞增殖及调节Aβ代谢、tau蛋白代谢等[12-15]，产生抗痴呆效应。然而，也有研究得出不同的结论。多个临床随机试验显示他汀类药物对于AD的治疗没有效果[16]。有研究显示statins类药物治疗(无论是亲脂性还是低亲脂性)并不能影响65岁以上老人AD及其他痴呆发生的危险性，甚至还有可能加重AD的病情[17]。有人推测可能与胆固醇的合成减少有关，导致以上不同结果的相关作用机制尚不清楚。

本实验通过细胞模型，研究洛伐他汀抗Aβ神经毒性损害的非胆固醇依赖性神经保护作用。结果显示，洛伐他汀作用浓度低于1 μmol/L(0.01 μmol/L和0.1 μmol/L)，对SH-SY5Y/APPSWE细胞基本没有毒性；同时，不会引起细胞胆固醇水平下降。所以，本实验选择了0.1 μmol/L的洛伐他汀建立非胆固醇依赖性神经细胞模型。

大量研究表明，Aβ是AD的重要致病因子之一。其异常代谢是引起Aβ堆积，老年斑形成等毒性作用的主要原因[1]。研究显示，Aβ不仅以单体和纤维状聚合体形式存在，还可以二、三和四聚体等寡聚体形式存在[3]。最初认为老年斑中仅仅是不可溶的纤维状Aβ有神经毒性作用，然而随后的研究发现APP转基因小鼠的认知功能异常、神经元及突触功能和结构改变出现在淀粉样斑块形成之前[18-19]。并且大量研究结果均提示，多种Aβ1-42寡聚体与非神经元及神经元细胞膜上的多种成分，包括脂类、离子通道、受体等相结合引起一系列复杂的突触、神经元和神经元网络功能及结构的异常，导致学习、记忆等行为异常[20-22]。有研究显示来源于AD病人大脑的Aβ二聚体具有毒性作用，可以直接损伤突触可塑性及记忆功能[23]。

在本实验中发现，过表达APP的SH-SY5Y/APPSWE细胞去血清培养48 h，与未过表达APP(Sweden 670/671)的SH-SY5Y/WT细胞比较，可观察到细胞存活率显著降低(P<0.01)，同时，SH-SY5Y/APPSWE细胞Aβ二聚体的蛋白表达水平明显高于SH-SY5Y/WT细胞；有趣的是，预先用0.1 μmol/L洛伐他汀处理细胞，可观察到由于APP过表达产生的过多内源性Aβ诱导的细胞毒性作用被减弱，与Aβ毒性作用组比较，细胞存活率显著上升(P<0.05)，细胞Aβ二聚体表达水平的下降(P<0.05)。上述实验数据说明洛伐他汀具有不依赖于降胆固醇作用的神经保护作用，可能与减少毒性Aβ二聚体的产生有关。

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(2016-10-15收稿，2016-11-28修回)

中文编辑： 刘 平； 英文编辑： 刘 华

Protective Effect of Lovastatin on SH-SY5Y Cells against β-amyloid Peptide in Non Cholesterol Dependence Way

ZHAO Liang1,2, GUAN Zhizhong2,3,4

(1.DepartmentofMicrobiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China; 2.DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.KeyLaboratoryofEndemicandEthnicDiseases,GuizhouMedicalUniversity,MinistryofEducation,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.KeyLaboratoryofMedicalMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To observe the effect of lovastatin on APP670/671 gene over-expressed human neuroblastoma SH-SY5Y cell activity and the synthesis of dimer of beta amyloid protein(Aβ). Methods: The human APP670/671 gene was transfected into the SH-SY5Y cells and identified. The best concentration of lovastatin which had no cell toxicity and did not affect the cell cholesterol concentration was screened, which treated SH-SY5Y cells for 24 h. Then, CCK-8 test was used to detect the cell survival rate, and Western blot was adopted to detect the protein expression level of Aβ dimer. Results: The protein and mRNA levels of APP in SH-SY5Y/APPSWE cells were obviously higher than the SH-SY5Y wild type cells. No toxic effect and no changes in cholestetol level were observed in the cells treated with 0.1 μmol/L lovastatin for 24 h. 0.1 μmol/l lovastatin pretreatment of SH-SY5Y cells with 24 h could improve the survival rate of cells and decreased Aβ dimer secretion. Conclusions: Lovastatin has a neuroprotective effect, which may be related to reducing the toxic Aβ dimer synthesis.

lovastatin; β-amyloid protein; amyloid precursor protein; Alzheimer's disease

国家自然科学基金(81260173)； 教育部“长江学者和创新团队发展计划资助”(IRT13058)； 贵州省科技计划[黔科合重大专项字(2014)6008号]； 贵州省创新计划项目[黔教合协同创新中心(2014)06]

时间：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.021.html

R749.16

A

1000-2707(2016)12-1370-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.002

**通信作者 E-mail:1457658298@qq.com