黄芩素减轻柔红霉素诱导的小鼠心肌损伤*

白小强， 王新兰， 韩小东,2**, 黄勇攀

(1.延安大学医学院, 陕西 延安 716000； 2.西安交通大学 第二附属医院, 陕西 西安 710049； 3.贵州医科大学 药理学教研室, 贵州 贵阳 550004； 4.中南大学湘雅医学院, 湖南 长沙 410078)



黄芩素减轻柔红霉素诱导的小鼠心肌损伤*

白小强1， 王新兰1， 韩小东1,2**, 黄勇攀3,4

(1.延安大学医学院, 陕西 延安 716000； 2.西安交通大学 第二附属医院, 陕西 西安 710049； 3.贵州医科大学 药理学教研室, 贵州 贵阳 550004； 4.中南大学湘雅医学院, 湖南 长沙 410078)

目的： 探讨黄芩素(Bai)对柔红霉素(Dox)致小鼠心肌损伤的保护作用，阐明其抗柔红霉素诱导的心肌损伤机制。方法： 80只小鼠随机分为5组(n=16)：对照组、Dox模型组和Bai高、中、低剂量组(40、20、10 mg/kg),腹腔注射柔红霉素(20 mg/kg)制备小鼠心脏毒性模型，检测心肌ALT、AST、CK、LDH、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽还原酶(GSH)水平，电镜观察心肌组织超微结构改变。结果： 心电图显示，Dox可导致小鼠心律失常；模型组小鼠心肌酶ALT、AST、CK、LDH水平显著升高，Bai高、中、低剂量组呈剂量依赖下降；模型组小鼠心肌SOD、CAT、GSH活性显著下降，MDA含量增多，Bai高、中、低剂量组呈浓度依赖升高，MDA含量降低；电镜显示Dox组小鼠心肌组织超微结构损伤明显，心肌细胞肿胀，部分肌丝排列紊乱，断裂溶解，线粒体明显肿胀，线粒体嵴断裂消失；Bai高、中、低剂量组小鼠心肌超微结构呈不同程度改善。结论： Bai对Dox致小鼠心肌损伤具有保护作用，其机制可能与其抗氧化活性有关。

黄芩素； 柔红霉素； 心脏毒性； 心肌酶

柔红霉素(doxorubicin，Dox)是临床上最为常用的蒽环类化疗药物之一，其抗肿瘤活性广泛，但由于该药物的心脏毒性限制了其在临床上的应用[1-3]，Dox心脏毒性自由基损伤被大多数研究者所接受。Dox能引起心肌细胞在代谢过程中产生活性氧(reaetive oxygen species，ROS)，过量的ROS攻击心肌细胞，增加心肌细胞内ROS的产生和降低心肌细胞内抗氧化物酶的活性，使心肌细胞处于氧化应激状态，从而引起心肌病和充血性心力衰竭。黄芩素(baicalein，Bai)是从中药黄芩中提取的黄酮类化合物，具有较强的抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化及清除氧自由基等广泛药理作用[4-5]，本研究通过建立Dox致小鼠心肌损伤模型，探讨Bai对心肌损害的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 昆明种小鼠80只，SPF级，雌雄各半，体重(20±2)g，由贵州医科大学实验动物中心提供，动物合格证号2004A062。

1.1.2 药物与试剂 柔红霉素购自延安大学附属医院药剂科，黄芩素(纯度98%)购自Sigma公司。临用前配制成40 mg/L的溶液。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶 MB同工酶(CK-MB)、SOD、MDA、CAT测试剂盒购自南京建成生物工程有限公司。

1.1.3 主要仪器 酶标仪购自Thermo公司，电动匀浆仪购自德国，H-7650型透射电镜购自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心脏毒性模型制备 小鼠适应性喂养1周后，检测心电图。随机将心电图正常小鼠随机分为如下5组：正常对照组(control组)、模型组 (Dox组)、黄芩素高剂量组(Dox+Bai 40 mg/L)、黄芩素中剂量组(Dox+Bai 20 mg/L)及黄芩素低剂量组(Dox+Bai 10 mg/L)，连续给药两周。除正常对照组腹腔注射等体积生理盐水外，其余各给药组小鼠均每3 d通过腹腔注射给予Dox(累积剂量20 mg/kg)，制备Dox心脏毒性模型，模型成功与否采用心电图来检测。各给药组动物于次日开始给予不同剂量黄芩素。1.2.2 心电图观察 Dox组，黄芩素高剂量组(40 mg/L)，黄芩素中剂量组(20 mg/L)，黄芩素低剂量组(10 mg/L)注射柔红霉素，对照组腹腔注射同体积的生理盐水12 h后，小鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧固定，采用标准肢体Ⅱ导联描记心电图，观察心律失常的发生率。以出现各种类型的期前收缩、房室传导阻滞、窦性心动过速、窦性心动过缓中的任何一项都视为心律失常。

1.2.3 标本收集 给药两周后，采用颈椎脱臼处死动物，取出心脏用预冷生理盐水冲洗，滤纸吸干后称重冰浴中取部分心室，用生理盐水制成 10%心肌组织匀浆，4 ℃，3 000转/min，离心10 min，取上清检测心肌ALT、AST、CK-MB、LDH、SOD、MDA、CAT等指标，前述检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2.4 病理组织学检查 采用水合氯醛(5%，1 mL/kg)深度麻醉小鼠后，剪开胸腔，暴露心脏，经左心室插入灌注针头，穿入主动脉内，同时剪开右心耳，快速灌注生理盐水约 20 mL，然后接换4 ℃ 4%多聚甲醛30 mL继续灌注，直至小鼠四肢强直、发白。此时固定完毕，开颅取脑，4%多聚甲醛固定24 h，制作石蜡切片，然后苏木精-伊红染色。

1.2.5 电镜观察 取实验动物心肌组织，1 mm×1 mm×1 mm，戊二醛(2.5%)和锇酸(1%)双重固定，丙酮脱水，树脂包埋，超薄切片，醋酸双氧铀(1%)及枸橼酸铅双重染色，透射电镜下观察。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 一般指标

对照组小鼠在实验期间饮水、进食、运动正常，体重稳定增加。给予Dox后，从实验第2、3天开始，实验动物活动少及进食减少、体重不增等；实验第5天开始出现腹水；随着实验时间的延长，上述现象更明显；第10天，Dox组有3只死于充血性心衰 (CHF)，尸检发现胸腹腔积液、肝肿大、心腔扩大、心室壁明显变薄等表现。各给药组动物也出现饮食差、活动少等表现；但给药后各给药组动物体重均有不同程度的增长，胸腹腔积液减轻，未见明显肝肿大、心腔扩大等表现。各给药组心律失常的发生率均降低，有统计学差异(P<0.05)，见表1。

表1 Bai对Dox诱导小鼠心电图的影响Tab.1 Effects of Bai on electrocardiogram in Dox-induced cardiotoxic mice

(1)与对照组比较，P<0.05;(2)与Dox组比较,P<0.05

2.2 Bai对小鼠心肌酶AST、ALT、LDH和CK-MB含量的影响

AST、ALT、LDH和CK水平升高提示心肌损伤，可作为临床诊断心肌组织损伤的评价指标。与正常对照组比较，Dox组小鼠心肌AST、ALT、LDH和CK-MB水平均显著升高(P<0.05)，具有统计学差异。与Dox组比较，各给药组小鼠AST、ALT、LDH和CK-MB水平含量降低，呈剂量依赖，具有统计学意义(P<0.05)，见图1A、B、C、D。

与对照组比较,(1)P<0.05,(2)P<0.01;与Dox组比较,(3)P<0.05,(4)P<0.01图1 Bai对Dox诱导小鼠心肌组织AST、ALT、LDH和CK-MB含量的影响Fig.1 Effects of Baicalin on the contents of CK-MB, ALT, LDH and AST in myocardial tissue of mice

2.3 Bai对小鼠心肌组织MDA、SOD、GSH和CAT的影响

与对照组比较，Dox组小鼠心肌组织MDA含量明显升高，SOD、CAT和GSH活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与Dox组比较，各给药组小鼠MDA含量呈剂量依赖地降低，SOD、CAT和GSH活性增高，见图2A、B、C、D。

与对照组比较, (1)P<0.05; 与Dox组比较, (2)P<0.05图2 Bai对Dox诱导小鼠心肌组织MDA、SOD、CAT和GSH的影响Fig.2 Effects of Bai on content of MDA and activities of SOD, CAT, GSH in myocardial tissue in Dox-induced cardiotoxic mice

2.4 Bai对小鼠心肌细胞形态学的影响

对照组小鼠心肌组织HE染色显示，心肌细胞排列整齐，纤维无破坏，细胞间隙正常，未见水肿。与对照组比较，Dox组小鼠心肌细胞多灶性变性和坏死，表现为心肌纤维丢失，肌浆溶解，间质和心肌细胞内空泡形成；坏死灶内可见单核、淋巴细胞浸润。各给药组：较模型组心肌损伤明显减轻，部分组织与正常大鼠心脏组织学无明显差异(图3)。

注：A为对照组，B为模型组，C为Bai高剂量组，D为Bai中剂量组，E为Bai低剂量组图3 Bai对Dox诱导小鼠心肌细胞形态学的影响(×200)Fig.3 Effects of Bai on myocardial tissue ultrastructure in DOX-induced cardiotoxic mice

2.5 Bai对小鼠心肌超微结构的影响

Dox引起心肌组织氧自由基损伤，其主要是心肌细胞器线粒体肿胀及空泡变性。Dox组心肌组织超微结构损伤明显，心肌细胞肿胀，部分肌丝排列紊乱，断裂溶解，线粒体明显肿胀，线粒体嵴断裂消失。而Bai高、中、低剂量组心肌组织超微结构损伤明显改善，线粒体水肿减轻，空泡样变性减少，少数心肌组织肌丝断裂，损伤较Dox组明显减轻，而且Bai高剂量组改善最为明显，心肌纤维结构基本趋于正常(图4)。

注：A为对照组，B为模型组，C为高剂量组，D为中剂量组，E为低剂量组图4 Bai对Dox诱导小鼠心肌超微结构的影响(×50 000)Fig.4 Effects of Bai on myocardial ultrastructure in DOX-induced cardiotoxic mice

3 讨论

Dox作为一种重要的蒽环类抗癌药物，在高效抗肿瘤的同时，对正常细胞也有损伤作用，尤其体现在对心肌组织的毒性[6]。大量文献认为，Dox引发心肌毒性的机制有多种学说，其中氧自由基损伤机制为多数学者所支持。Dox与心肌细胞具有独特的亲和力，极易在心脏中蓄积，当Dox进入心肌细胞后，导致线粒体内呼吸链功能异常，大量的ROS产生，ROS进而攻击心肌细胞，引起心肌细胞氧化损伤。心肌细胞膜受损后，细胞膜通透性增大，造成胞内多种酶外漏，如ALT、AST、LDH等，严重影响心肌纤维的舒缩功能。因此，心肌细胞损伤的心肌酶谱生化指标ALT、AST、LDH、CK、CK-MB可以用来评价Dox致心肌损伤的严重程度。

本研究通过腹腔注射Dox致小鼠心肌损伤模型，分4次给完，Dox累计剂量为20 mg/kg，发现模型组小鼠体重减轻明显，心律失常发生率高达70%，心肌组织匀浆心肌酶ALT、AST、LDH、CK水平显著升高。不同浓度Bai降低ALT、AST、LDH、CK水平，呈剂量依赖，从而减轻心肌损伤。

MDA是细胞膜脂质过氧化产物，常用来反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。正常情况下SOD、CAT和GSH在构成了细胞内在的抗氧化防御系统，其活性高低反映机体清除氧自由基的能力。Dox抑制心肌细胞SOD和CAT等抗氧化酶的活性[7-8]。本研究显示Dox致小鼠心肌组织MDA含量升高，SOD、CAT和GSH活性降低，心肌超微结构改变明显，如线粒体肿胀明显及空泡变性、肌丝断裂、线粒体嵴断裂。Bai明显降低心肌组织MDA含量，提高SOD、CAT和GSH活性。电镜下观察，可见心肌组织超微结构损伤明显改善，线粒体水肿程度减轻，空泡样变性减少。Bai作为一种天然黄酮类化合物，其具有清除自由基及较强的抗氧化能力，通常用于心脑血管疾病的防治[9]。本研究显示Bai对Dox致小鼠心肌损伤后氧化与抗氧化系统的保护作用，其机制可能与提高心肌抗氧化酶活性和清除自由基有关。

研究表明，Dox引起心肌组织损伤其机制为氧化应激所致氧自由基大量产生，影响了细胞膜结构的完整性，导致心肌细胞亚细胞结构变化，包括心肌细胞支架结构完整性的丧失，线粒体肿胀等[10]。本研究发现，Bai可以改善心肌超微结构损伤。综上所述，Bai能减轻Dox致心肌氧自由基损伤，从而降低其心脏毒性。

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(2016-09-15收稿，2016-11-26修回)

中文编辑： 刘 平； 英文编辑： 刘 华

Amelioration of Doxorubicin-induced Myocardial Injury in Mice by Baicalein

BAI Xiaoqiang1, WANG Xinlan1, HAN Xiaodong1,2, HUANG Yongpan3，4

(1.MedicalCollege,YananUniversity,Yanan716000,Shaanxi,China; 2.theSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,Xi'an710049,Shaanxi,China; 3.DepartmentofPharmacology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004Guizhou,China; 4.XiangyaMedicalCollege,CentralSouthUniversity,Changsha410078,Hunan,China)

Objective: To investigate the protective effect of Baicalein(Bai) on the myocardial injury induced by Doxorubicin(Dox) in mice, and to elucidate the mechanism of myocardial injury induced by Dox. Methods: 80 mice were randomly divided into five groups (n=16): control group, Dox model group, high, medium and low Bai dose group (40,20,10 mg/kg). Intraperitoneal injection of Dox (20 mg/kg) was adopted to establish mouse cardiac toxicity model. Myocardial ALT, AST, CK, LDH, superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), catalase (CAT), glutathione reductase (GSH) level were detected, and electron microscope was used to observe the changes of myocardial tissue ultrastructure. Results: ECG showed that DOX could lead to mice arrhythmia. In model group of mice, myocardial enzyme such as ALT, AST, CK, LDH levels were significantly elevated,while in high, medium and low Bai dose group the myocardial enzyme activities showed a dose-dependent decline. In the model group, SOD, CAT, GSH activity was significantly decreased, while MDA content increased. In high, medium and low Bai dose group SOD, CAT, GSH activity showed a concentration-dependent increase, while MDA content decreased. Electron microscope showed that the ultrastructure of myocardial tissue in Dox group was obviously damaged, the myocardial cells were swollen, some of the muscle fibers arranged in disorder and were broken to dissolution, the mitochondria was obviously swollen, and the the mitochondrial crest disappeared. In high, medium and low Bai dose group, myocardial tissue ultrastructure improved to different degree. Conclusion: Baicalin can play a protective role on myocardial injury induced by Doxorubicin in mice, and the mechanism may be related to its antioxidant activity.

baicalein; doxorubicin; cardiotoxicity; myocardial enzymes

陕西教育厅科学研究项目(12JK0755)； 延安市科技惠民项目(2014HM-05)

时间：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.007.html

R965.1

A

1000-2707(2016)12-1430-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.014

**通信作者 E-mail:haorenbudazhe@126.com