干扰趋化因子CC受体-2调控p38MAPK信号通路抑制人口腔黏膜上皮细胞系增殖的机制

赵 永 程志芬 玄延花

(南阳医学高等专科学校第一附属医院口腔科，河南 南阳 473000)

干扰趋化因子CC受体-2调控p38MAPK信号通路抑制人口腔黏膜上皮细胞系增殖的机制

赵 永 程志芬1玄延花2

(南阳医学高等专科学校第一附属医院口腔科，河南 南阳 473000)

目的探讨干扰趋化因子CC受体(CCR)2基因的表达对口腔黏膜上皮细胞增殖的影响及机制。方法Western印迹检测CCR2在口腔黏膜下纤维性变(OSF)中的表达；用CCR2的siRNA转染人口腔黏膜上皮细胞系(HOMC)细胞，转染48 h后用Western印迹检测各组细胞中CCR2蛋白表达；细胞增殖与活性检测(CCK8)实验检测细胞增殖；Western印迹检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化(p)-p38MAPK蛋白表达。结果CCR2在OSF组织中的表达显著高于正常口腔黏膜组织(P<0.01)；阴性对照(NC)-siRNA组CCR2蛋白表达、细胞存活率及p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；CCR2-siRNA组CCR2蛋白表达、细胞存活率及p-p38MAPK蛋白表达均显著低于对照组(P<0.01)。结论CCR2在OSF中高表达，抑制CCR2的表达可通过调控p38MAPK信号通路抑制HOMC的增殖。

趋化因子CC受体-2；口腔黏膜下纤维性变；口腔黏膜上皮细胞；增殖

口腔黏膜下纤维性变(OSF)是一种发生于口腔黏膜的隐匿性、慢性口腔黏膜病变〔1〕，不仅限制了大量临床口腔修复治疗，同时有癌变潜能，目前其发病机制尚不清楚。单核细胞趋化蛋白(MCP)-1是β类趋化因子家族中的一员，参与炎性细胞的激活及趋化过程，趋化因子CC受体(CCR)2是MCP-1的主要受体〔2〕。研究显示，CCR2在多种纤维化病变、全身炎性病变、肿瘤、口腔黏膜组织及OSF组织中高表达〔3，4〕。但目前关于CCR2对OSF的影响还未明确。本研究旨在探究抑制CCR2表达对人口腔黏膜上皮细胞系(HOMC)增殖的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1材料 收集2015年1月至2016年12月南阳医学高等专科学校第一附属医院口腔科收治的患者30例，均经临床及病理确诊、无其他系统疾病、未经特殊治疗且无其他口腔黏膜疾病，取口腔颊黏膜的病变组织作为实验组。30例对照组为同期在该院进行第3颗磨牙及外伤清创修剪不整齐颊黏膜组织时获得。患者、家属均知情同意。HOMC购自中国医学科学院。

1.2主要试剂和仪器 D-KSFM培养基购自美国Sigma公司；p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化(p)-p38MAPK抗体均购自美国abcam公司；转染试剂盒LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)试剂盒购自北京康为世纪生物技术有限公司；细胞增殖与活性检测(CCK8)增殖试剂盒购自碧云天生物技术研究所；酶标仪购自美国Molecular Devices。

1.3CCR2在OSF中的表达 提取两组总蛋白后用BCA试剂盒定量蛋白。取40 μg蛋白样品行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，电泳后电转移硝酸纤维素膜，封闭后4℃孵育，均按照1∶1 000稀释的CCR2和GAPDH抗体过夜，加入二抗，室温孵育2 h。根据电化学发光(ECL)化学试剂盒的说明进行显影，用Quantity one软件对蛋白灰度值进行分析。

1.4细胞培养及转染 HOMC在含有10%胎牛血清(FBS)及1%双抗的D-KSFM培养基中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。取生长至对数期的细胞，按照Invitrogen 公司的LipofectamineTM2000转染方法将合成的不具有干扰作用的阴性对照siRNA(NC-siRNA)及干扰CCR2表达的siRNA(CCR2-siRNA)转染至HOMC内，设定未经特殊处理的细胞为对照组，转染过程严格按照试剂盒操作。收集培养48 h的3组细胞，检测细胞中CCR2的蛋白表达。

1.5细胞增殖检测 以每毫升含有3×104个细胞每孔加200 μl接种3组细胞于96孔板，培养箱内48 h后每孔加入CCK8液10 μl，37℃孵育0.5～2.0 h，酶标仪490 nm测定吸光度A并计算细胞增殖率，细胞增殖率=(转染组细胞A/对照组细胞A)×100%。

1.6Western印迹检测p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达 各组细胞培养48 h后，提取细胞中的蛋白，按照1.3方法检测各组细胞中p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达。

1.7统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析，t检验。

2 结 果

2.1CCR2在OSF组织中的表达 CCR2在OSF组织(0.255±0.034)中的表达显著高于正常口腔黏膜组织(0.115±0.023，P<0.01)。

2.2CCR2-siRNA转染后细胞中CCR2的表达及对细胞增殖的影响 NC-siRNA组CCR2蛋白表达(0.349±0.047)及细胞存活率(93.82±5.32)%与对照组〔(0.345±0.043)、(94.73±4.81)%〕差异无统计学意义(P>0.05)。CCR2-siRNA组〔(0.103±0.025)、(65.91±6.64)%〕均显著低于对照组(P<0.01)。

2.3抑制CCR2的表达对p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达的影响 NC-siRNA组p38MAPK(0.256±0.036)、p-p38MAPK(0.096±0.012)蛋白表达与对照组(0.255±0.036)、(0.097±0.015)差异无统计学意义(P>0.05)，CCR2-siRNA组p-p38MAPK(0.023±0.011)蛋白表达显著低于对照组(P<0.01)，p38MAPK(0.253±0.035)蛋白表达与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。

3 讨 论

OSF是一种进行性硬化病变，目前认为其发生与营养不良、免疫、咀嚼槟榔、遗传等多种因素有关〔5〕。CCR2属于G蛋白耦联受体，在树突细胞、嗜碱细胞、T淋巴细胞等多种细胞的表面表达〔6〕。研究显示，敲除CCR2基因的小鼠血脑屏障通透性、脑梗死面积及脑水肿的形成明显减少〔7〕。在口腔黏膜组织中CCR2高表达〔8〕。本研究检测CCR2在OSF组织也高表达。

RNA干扰能特异、高效地抑制目的基因表达，是目前研究基因功能的新方法，已得到广泛应用〔9〕。研究显示，沉默CCR2的表达能显著抑制人高转移前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，同时促进细胞凋亡〔10〕。本研究结果显示沉默CCR2能显著抑制HOMC的增殖。

p38MAPK信号通路是MAPK信号通路中重要的一员，是参与启动细胞凋亡的重要通路，被刺激信号激活后发挥生物学效应，可调节细胞的增殖、分化、凋亡等生理过程。研究显示，p38MAPK信号通路的阻断可明显减低炎症反应，减轻缺血再灌注损伤。抑制p38MAPK的表达可阻止人骨髓间充质干细胞的分化。本研究结果显示，抑制CCR2的表达能显著下调p-p38MAPK蛋白表达。

1Idrees F，Patel P，Newaskar V，etal.Surgical defect coverage in oral submucous fibrosis patients with single-stage extended nasolabial flap〔J〕.Oral Maxillofac Surg，2016；20(4)：411-5.

2Graupera I，Solà E，Fabrellas N，etal.Urine monocyte chemoattractant protein-1 is an independent predictive factor of hospital readmission and survival in cirrhosis〔J〕.PLoS One，2016；11(6)：e0157371.

3Sun RL，Huang CX，Bao JL，etal.CC-chemokine ligand 2 (CCL2) suppresses high density lipoprotein (HDL) internalization and cholesterol efflux via CC-chemokine receptor 2 (CCR2) induction and p42/44 mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation in human endothelial cells〔J〕.J Biol Chem，2016；291(37)：19532-44.

4Christopher AF，Gupta M，Bansal P.Micronome revealed miR-19a/b as key regulator of SOCS3 during cancer related inflammation of oral squamous cell carcinoma〔J〕.Gene，2016；594(1)：30-40.

5Joshi S，Kamalapur M，Patil P，etal.2089208 Ultrasound evaluation and grading of oral submucous fibrosis〔J〕.Ultrasound Med Biol，2015；41(4)：S14-5.

6Talbot J，Bianchini FJ，Nascimento DC，etal.CCR2 expression in neutrophils plays a critical role in their migration into the joints in rheumatoid arthritis〔J〕.Arthritis Rheumatol，2015；67(7)：1751-9.

7O′Connor T，Borsig L，Heikenwalder M.CCL2-CCR2 signaling in disease pathogenesis〔J〕.Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2015;15(2)：105-18.

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10Mandal RK，Agrawal T，Mittal RD.Genetic variants of chemokine CCL2 and chemokine receptor CCR2 genes and risk of prostate cancer〔J〕.Tumor Biol，2015;36(1)：375-81.

R78

A

1005-9202(2017)23-5792-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.018

吉林省教育厅“十三五”科学技术研究项目(吉教科合字〔2016〕第266号)

1 郑州大学第一附属医院 郑州大学口腔医学院

2 延边大学医学院病理学教研部

玄延花(1973-)，女，医学博士，副教授，主要从事病理学研究。

赵 永(1975-)，男，副主任医师，主要从事口腔疾病的研究。

〔2017-09-25修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)