高良姜素结构修饰及对K562细胞的抑制活性

赵 玲, 吴斐华

(1. 武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉430023；2. 中国药科大学中药药理教研室，江苏 南京 211198)

高良姜素结构修饰及对K562细胞的抑制活性

赵 玲1, 吴斐华2

(1. 武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉430023；2. 中国药科大学中药药理教研室，江苏 南京 211198)

对高良姜素进行结构修饰，期望得到活性更好的抑制K562细胞增殖的衍生物，并初步总结构效关系。通过化学法以高良姜素为母核进行结构修饰得到了12个衍生物，经MTT法测定了高良姜素及其衍生物在5种不同浓度下培养48 h对K562细胞的抑制活性。12个衍生物中有10个为新化合物。化合物A-1、A-6、A-7、A-8、A-9、A-11和高良姜素活性良好，在浓度为100μmol/L时，对K562细胞的抑制率均大于50%，其中A-1，A-6，A-7这3个衍生物的活性较高良姜素活性好，且A-1 活性最强，其IC50为16.7 μmol/L。通过本研究发现了活性较强的高良姜素衍生物，并发现在高良姜素3位羟基进行适当的结构修饰可以大大增强对K562细胞的抑制活性，但因所做衍生物数目有限，深入的构效关系总结还有待进一步研究。

高良姜素；结构修饰；K562细胞；抑制活性

1 引言

高良姜素(galangin, 3, 5, 7- 三羟基黄酮) 是一种天然的黄酮醇类化合物，现已发现可从中药高良姜(AlpiniaofficinarumHance. ) 的根茎[1-2]、植物Helichrysumaureonitens的地上部分[3-4]及多个地区的蜂胶[5-6]中提取分离得到。近年来国内外对该成分的药理药效活性进行了大量研究，发现其具有显著的抗肿瘤活性[7-16]。Xiaoliang Liu[16]等研究发现，高良姜素对多种白血病细胞具有直接的抑制作用，且能增强抗白血病药物——甲磺酸伊马替尼对白血病细胞的细胞毒性[13]。鉴于此，结合前期从高良姜中分离得到的大量的高良姜素单体化合物，对其进行一系列的结构修饰，并进行人髓系白血病K562细胞增殖抑制作用的研究，期待发现活性更好的高良姜素衍生物，并进行构效关系研究，为抗白血病新药研发奠定基础。

2 材料和仪器

2.1 试剂与药品

高良姜素为武汉轻工大学生物与制药工程学院自制；桂皮酸为化学纯，第二军医大学朝晖制药厂生产；二环己基碳二亚胺(DCC)为分析纯，中国佘山化工厂生产；醋酐、吡啶、溴化苄均为分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司生产；碘化钠为化学纯，南翔试剂厂生产；氯化钠、碳酸氢钠、碳酸钾均为分析纯，南京化学试剂厂生产；石油醚、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷均为分析纯，天津化学试剂厂生产。柱色谱硅胶100―200目、200―300目(青岛海洋化工厂产品)和薄层色谱硅胶GF254(烟台化工研究所)。RPM I-1640 培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制品研究所)；噻唑蓝(MTT，美国Sigma公司)。细胞株：K562细胞(美国ATCC公司)。

2.2 仪器与器材

Brucker ACF-300，500 型核磁共振波谱仪； HP-100 型质谱仪(LC/MSD System，ESI Mode)。Multiskan spectrum MSS1500-320酶标仪、3111型细胞培养箱(Thermo Electron 公司)；SW-CJ-IF超净台(苏州安泰空气技术公司)；XSZ-D2倒置显微镜(重庆光学仪器厂)；1-15K低温离心机(Sigma 公司)。

3 实验和方法

3.1 化合物的合成方法

3.1.1 化合物A-1和化合物A-2

称取高良姜素1.0 g溶于25 mL丙酮中，加入0.5 g碳酸钾和0.45 mL溴化苄，回流12 h后，停止反应。过滤，回收丙酮，固体经硅胶柱层析，石油醚乙酸乙酯梯度洗脱，得黄色粉末A-1(13.4 mg, 收率10%)，A-2(670 mg, 收率80%)。

3.1.2 化合物A-3

称取A-2 225 mg溶于25 mL丙酮中，加入690 mg碳酸钾和0.2 mL硫酸二甲酯，回流11 h停止反应。过滤，回收丙酮，固体经硅胶柱层析，石油醚乙酸乙酯洗脱，得砖红色粉末A-3(40.4 mg, 收率17.4%)。

3.1.3 化合物A-4

称取A-2 225 mg溶于25 mL丙酮中，加入1g碳酸钾和0.5 mL2-溴丙烷，200 mg碘化钠催化，回流36 h停止反应。过滤，回收丙酮，固体经硅胶柱层析，石油醚乙酸乙酯洗脱，得黄色粉末A-4(35.8 mg, 收率14.6%)。

3.1.4 化合物A-5

称取高良姜素135 mg溶于20 mL吡啶中，加入51 mg醋酐，室温搅拌4 h停止反应。反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯层再用饱和氯化钠溶液洗2次。乙酸乙酯层回收溶剂，固体经硅胶柱层析，石油醚乙酸乙酯洗脱，得黄色粉末A-5 (39.2 mg, 收率25.1%)。

3.1.5 化合物A-6

称取高良姜素135 mg溶于20 mL丙酮中，加入0.3 g碳酸钾和0.5 mL 2-溴丙烷，回流60 h停止反应。过滤，回收丙酮，固体经硅胶柱层析，石油醚乙酸乙酯洗脱，得黄色粉末A-6(96.0 mg, 收率54.2%)。

3.1.6 化合物A-7

称取高良姜素135 mg溶于25 mL二氯甲烷中，加入124 mg肉桂酸和123.6 mg二环己基碳二亚胺(DCC), 18.4 mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)作催化剂。室温搅拌20 h停止反应。反应液过滤，回收溶剂，固体经硅胶柱层析，石油醚乙酸乙酯洗脱，得黄色粉末A-7(80.0 mg, 收率40%)。

3.1.7 化合物A-8

称取高良姜素135 mg溶于25 mL二氯甲烷中，加入108 mg三氟肉桂酸和123.6 mg二环己基碳二亚胺(DCC), 20.0 mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)作催化剂。室温搅拌20 h停止反应。反应液过滤，回收溶剂，固体经硅胶柱层析，石油醚乙酸乙酯洗脱，得黄色粉末A-8(98.3 mg, 收率42.0%)。

3.1.8 化合物A-9

称取高良姜素135 mg溶于25 mL二氯甲烷中，加入104 mg 3,4-二甲氧基肉桂酸和123.6 mg二环己基碳二亚胺(DCC), 19.2 mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)作催化剂。室温搅拌20 h停止反应。反应液过滤，回收溶剂，固体经硅胶柱层析，石油醚乙酸乙酯洗脱，得黄色粉末A-9(92.0 mg, 收率40.0%)。

3.1.9 化合物A-10

称取高良姜素135 mg溶于25 mL二氯甲烷中，加入142 mg 3-甲氧基-4-苄基肉桂酸和123.6 mg二环己基碳二亚胺(DCC), 20.1 mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)作催化剂。室温搅拌20 h停止反应。反应液过滤，回收溶剂，固体经硅胶柱层析，石油醚乙酸乙酯洗脱，得黄色粉末A-10(99.7 mg, 收率37.2%)。

3.1.10 化合物A-11

称取高良姜素135 mg溶于25 mL二氯甲烷中，加入127.0 mg 4-苄基肉桂酸和123.6 mg二环己基碳二亚胺(DCC), 20.1 mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)作催化剂。室温搅拌20 h停止反应。反应液过滤，回收溶剂，固体经硅胶柱层析，石油醚乙酸乙酯洗脱，得黄色粉末A-11(93.6 mg, 收率37.0%)。

3.1.11 化合物A-12

称取高良姜素135 mg溶于25 mL二氯甲烷中，加入142 mg 4-甲氧基-3-苄基肉桂酸和123.6 mg 二环己基碳二亚胺(DCC), 20.1 mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)作催化剂。室温搅拌20 h停止反应。反应液过滤，回收溶剂，固体经硅胶柱层析，石油醚乙酸乙酯洗脱，得黄色粉末A-12(95.7 mg, 收率35.7%)。

3.2 MTT法检测化合物对K562细胞的增殖抑制实验方法

K562 细胞(人慢性粒细胞白血病细胞)常规培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液(青霉素 100 U/mL、链霉素 100 U/mL)中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。每2―3 d传代1 次，取对数生长期细胞进行实验。

取对数生长期K562配制成密度为105/mL 细胞悬液，接种于96孔细胞培养板 (2×104cell/孔)内，实验分组如下：空白对照组为K562细胞与0.4%的DMSO共培养，药物组为K562细胞与化合物(10 μmol/L, 20 μmol/L，30 μmol/L, 60 μmol/L，100 μmol/L)共培养。分别培养48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液5 mg/L，再培养4 h后，弃培养液，加入150 μL的DMSO原液，振荡10 min，待结晶完全溶解后，在酶标仪570 nm处测定吸光度A 值。实验至少重复3次，每次3个复孔。细胞增殖的抑制率按以下公式计算：抑制率=(空白对照组A570-化合物组A570)/空白组A570 ×100%

3.3 统计学处理

4 实验结果

4.1 化合物结构数据

本实验共合成了12个高良姜素衍生物，结构如图1所示。除了A-1和A-5不是新化合物外，其余10个衍生物均为新化合物，结构均经氢谱和质谱确定。具体数据如下。

图1 高良姜素衍生物

A-1：黄色粉末，分子式C22H16O5。ESI-MS m/z 359 [M-H]-, 分子量为360。1H-NMR (DMSO-d6, 500MHz)：12.60 (1H, s, 5-OH), 10.90 (1H, s, 7-OH), 7.28-7.32 (5H, m, H-3″, 4″, 5″, 6″, 7″), 6.25 (1H, d, J=2.1, H-6), 6.46 (1H, d, J=2.1, H-8), 7.95 (2H, dd, J=6.6, 1.7, H-2′, H-6′), 7.52-7.56 (3H, m, H-3′, 4′, 5′), 5.06 (2H, s, H-1″)。

A-2：黄色粉末，分子式C29H22O5。ESI-MS m/z 485 [M+Cl]-, 分子量为450。1H-NMR (DMSO-d6, 500MHz)：12.58 (1H, s, 5-OH), 7.97 (2H, dd, J=5.3, 1.0, H-2′, 6′), 7.53-7.57 (3H, m, H-3′, 4′, 5′), 6.56 (1H, d, J=2.1, H-6), 6.85 (1H, d, J=2.1, H-8), 5.07 (2H,s, H-1″), 7.28-7.32 (5H, m, H-3″, 4″, 5″, 6″, 7″), 5.25 (2H, s, 1‴), 7.47 (2H, m, H-3‴, 7‴), 7.42 (2H, m, H-4‴, 6‴), 7.36 (1H, m, H-5‴)。

A-3：黄色粉末，分子式C30H24O5。ESI-MS m/z 465 [M+H]+, 分子量为464。1H-NMR (DMSO-d6, 300MHz)： 7.99 (2H, dd, J=7.5, 2.3, H-2′, 6′), 7.52-7.55 (3H, m, H-3′, 4′, 5′), 6.64 (1H, d, J=2.2, H-6), 6.94 (1H, d, J=2.2, H-8), 5.03 (2H, s, H-1″), 7.31-7.37 (5H, m, H-3″, 4″, 5″, 6″, 7″), 5.28 (2H, s, 1‴), 7.52-7.55 (2H, m, H-3‴, 7‴), 7.39-7.48 (3H, m, H-4‴, H-5‴, 6‴), 3.90 (3H, s, 5-OCH3).

A-4：黄色粉末，分子式C32H28O5。ESI-MS m/z 493 [M+H]+, 分子量为492。1H-NMR (DMSO-d6, 300MHz)： 8.00 (2H, dd, J=7.5, 2.2, H-2′, 6′), 7.50-7.52 (3H, m, H-3′, 4′, 5′), 6.60 (1H, d, J=2.2, H-6), 6.89 (1H, d, J=2.2, H-8), 5.00 (2H, s, H-1″), 7.28-7.34 (5H, m, H-3″, 4″, 5″, 6″, 7″), 5.25 (2H, s, 1‴), 7.45-7.50 (2H, m, H-3‴, 7‴), 7.38-7.45 (3H, m, H-4‴, H-5‴, 6‴), 4.72 (1H, m, 5-CH(CH3)2), 1.33 (6H, d, J=6.0, 5-CH(CH3)2).

A-5：黄色粉末，分子式为C17H12O6。EI-MS(m/z): 312(分子离子峰)，1H-NMR (DMSO-d6, 300MHz)：5.98 (1H, d, J=2.1, H-6), 6.19 (1H, d, J=2.1, H-8), 7.80 (2H, m, H-2′, H-6′), 7.56-7.59 (3H, m, H-3′, 4′, 5′), 2.28(3H, s, 3-OCOCH3).

A-6：黄色粉末，分子式C21H22O5。ESI-MS m/z 353[M-H]-, 分子量为354。1H-NMR (DMSO-d6, 300MHz)：12.64 (1H, s, 5-OH), 8.00 (2H, dd, J=7.5, 2.5, H-2′, 6′), 7.46-7.50 (3H, m, H-3′, 4′, 5′), 6.32 (1H, d, J=2.1, H-6), 6.42(1H, d, J=2.1, H-8), 4.60(2H, m, 3,7-CH(CH3)2), 1.17, 1.39(6H, d, J=6.1, 3, 7-CH(CH3)2).

A-7：黄色粉末，分子式C24H16O6。ESI-MS m/z 399[M-H]-, 分子量为400。1H-NMR (DMSO-d6, 300MHz)：12.08 (1H, s, 5-OH), 6.15 (1H, d, J=2.1, H-6), 6.39 (1H, d, J=2.1, H-8), 7.81-7.93 (5H, m, H-2′, 3′, 4′, 5′, 6′), 6.94 (1H, d, J=16.0, H-1″), 7.90 (1H, d, J=16.0, H-2″), 7.57-7.59 (2H, m, H-4″, 8″), 7.46-7.49 (3H, m, H-5″, 6″, 7″).

A-8：黄色粉末，分子式为C25H15O6F3。ESI-MS m/z 467[M-H]-, 分子量为468。1H-NMR(DMSO-d6, 500MHz)：12.06 (1H, s, 5-OH), 5.90(1H, d, J=2.1, H-6), 6.11(1H, d, J=2.1, H-8), 8.05 (2H, dd, J=8.5, 2.0, H-2′, 6′), 7.55-7.56(3H, m, H- 3′, 4′, 5′) 7.08 (1H, d, J=16.0, H-1″), 7.98(1H, d, J=16.0, H-2″), 7.83(2H, d, J=8.0, H-4″, 8″), 7.84-7.86(2H, m, H-5″, 7″).

A-9：黄色粉末，分子式C26H20O8。ESI-MS m/z 459[M-H]-, 分子量为460。1H-NMR(DMSO-d6, 500MHz)：12.09 (1H, s, 5-OH), 6.08 (1H, brs, H-6), 6.22 (1H, brs, H-8), 7.85 (2H, m, H-2′, 6′), 7.55-7.57 (3H, m, H- 3′, 4′, 5′), 6.82 (1H, d, J=16.0, H-1″), 7.81 (1H, d, J=16.0, H-2″), 7.45 (1H, d, J=1.5, H-4″), 7.02 (1H, d, J=8.0, H-7″), 7.34 (1H, dd, J=8.0, 1.5, H-8″), 3.82, 3.83 (6H, each s, 5″, 6″-OCH3).

A-10：黄色粉末，分子式为C32H24O8。ESI-MS m/z 535[M-H]-, 分子量为536。1H-NMR (DMSO-d6, 500MHz)：12.09 (1H, s, 5-OH), 5.91 (1H, brs, H-6), 6.11 (1H, brs, H-8), 7.83 (2H, m, H-2′, 6′), 7.55-7.57 (3H, m, H- 3′, 4′, 5′), 6.81 (1H, d, J=16.0, H-1″), 7.79(1H, d, J=16.0, H-2″), 7.45 (1H, d, J=1.5, H-4″), 7.11 (1H, d, J=8.0, H-7″), 7.31 (1H, dd, J=8.0, 1.5, H-8″). 5.16 (2H, s, H-1‴), 7.47 (2H, m, H-3‴, 7‴), 7.40 (2H, m, H-4‴, 6‴), 7.35(1H, m, H-5‴), 3.84 (3H, s, 5″-OCH3).

A-11：黄色粉末，分子式为C31H22O7。ESI-MS m/z 505[M-H]-, 分子量为506。1H-NMR (DMSO-d6, 500MHz)：12.09 (1H, s, 5-OH), 5.59 (1H, brs, H-6), 5.75 (1H, brs, H-8), 7.77 (2H,m, H-2′, 6′), 7.49-7.53 (3H, m, H- 3′, 4′, 5′), 6.73 (1H, d, J=16.0, H-1″), 7.80 (1H, d, J=16.0, H-2″), 7.76 (2H, d, J=9.0, H-4″, 8″), 7.08 (2H, d, J=9.0, H-5″, 7″), 5.16 (2H, s, H-1‴), 7.47 (2H, d, m, H-3‴, 7‴), 7.40 (2H, d, m, H-4‴, 6‴), 7.33 (1H, m, H- 5‴).

A-12：黄色粉末，分子式为C32H24O8。ESI-MS m/z 535[M-H]-, 分子量为536。1H-NMR (DMSO-d6, 500MHz)：12.20 (1H, s, 5-OH), 6.29 (1H, d, J=1.5, H-6), 6.54 (1H, d, J=1.5, H-8), 7.90 (2H, m, H-2′, 6′), 7.55-7.60 (3H, m, H- 3′, 4′, 5′), 6.83 (1H, d, J=16.0, H-1″), 7.82 (1H, d, J=16.0, H-2″), 7.59 (1H, d, J=1.5, H-4″), 7.06 (1H, d, J=8.5, H-7″), 7.32 (1H, dd, J=8.0, 1.5, H-8″), 5.16 (2H, s, H-1‴), 7.47 (2H, m, H-3‴, 7‴), 7.41(2H, m, H-4‴, 6‴), 7.35 (1H, m, H-5‴), 3.84 (3H, s, 6″-OCH3).

4.2 MTT法检测结果

体外培养的K562细胞经5种不同浓度的13个化合物作用48 h 后，MTT结果显示，所有化合物对K562细胞均具有一定的抗增殖活性，且随着浓度的升高，抑制率逐渐增强。化合物A-1、A-6、A-7、A-8、A-9、A-11和高良姜素活性良好，在浓度为100 μM时，对K562细胞的抑制率均大于50%；A-6在浓度为60 μM时，其抑制率可达54.4%；A-7活性较A-6好，在较低浓度(30 μM)时，抑制率即可超过50%；A-1 活性最强，不仅在30 μM低浓度下抑制率可达65.5%，且当浓度增至100 μM时，其对K562细胞的抑制率更是高达83.2%，活性最佳。具体抑制率数据见表1。各化合物抑制K562细胞增殖的IC50经计算，A-1为16.7 μmol/L，A-6为50.5 μmol/L，A-7为33.0 μmol/L，高良姜素为60.9 μmol/L，具体数据见表2。

化合物抑制率/%100μM60μM30μM20μM10μMA⁃183．2±3．675．8±2．665．5±5．249．9±4．540．0±7．7A⁃217．6±2．714．7±2．81．7±0．31．6±1．91．3±3．3A⁃339．2±6．332．2±5．727．6±2．49．9±2．35．7±2．2A⁃423．2±4．211．7±3．28．4±3．07．1±3．23．6±2．4A⁃539．5±5．431．9±5．219．5±4．217．8±2．213．1±4．2A⁃671．8±4．754．4±3．639．3±4．017．0±2．811．3±3．9A⁃775．8±3．467．7±3．953．7±7．828．1±2．423．6±1．3A873．7±4．547．0±6．522．3±3．89．1±3．37．1±3．3A⁃960．4±59．224．8±3．414．9±4．612．5±2．98．4±3．2A⁃1034．1±3．323．7±4．08．0±3．65．7±3．62．1±3．4A⁃1154．9±5．036．6±6．429．8±2．621．4±2．213．3±4．4A⁃1236．0±3．527．8±4．814．5±3．712．0±2．85．0±2．7高良姜素61．7±3．546．9±6．336．5±3．726．2±9．611．8±3．8

表2 化合物抑制K562细胞的IC50/(μmol/L)

化合物IC50化合物IC50A⁃116．7A⁃861．6A⁃2308．4A⁃9107．8A⁃3123．9A⁃10152．6A⁃4514．8A⁃1190．8A⁃5205．8A⁃12163．3A⁃650．5A⁃733．0高良姜素60．9

5 讨论

从以上实验结果可以看出，12个高良姜素衍生物中，A-1，A-6，A-7活性较高良姜素好，A-8与高良姜素活性相当。从结构上分析可以看出，仅在高良姜素3位羟基引入苄基(A-1)时，活性显著增强，其IC50值为16.7 μmol/L，比高良姜素活性高出3.6倍，同时对比化合物A-2，A-3，A-4的活性和结构可以看出，高良姜素母核3位和7位羟基同时引入苄基取代时，活性锐减，说明7位羟基的保留对活性很重要；3位羟基引入的取代基的结构对活性亦有很大影响，比较A-1、A-5和A-7的结构和活性可以看出，3位引入苄基活性显著增强，而引入乙酰基则活性显著降低很多，引入肉桂酰基活性亦增强，但是在肉桂酰基上有取代基时(A-8—A-11)，活性均降低，可能跟基团的空间结构有一定的关系。在3,7位羟基同时引入异丙基时(A-6)，活性反而略有增强，其原因是否为受短链烷烃的供电子效应和空间效应影响，并不清楚，因此关注短链烷烃取代基对活性的影响，也是后续研究的一个重点方向。

本论文结构修饰物的数目有限，但从目前活性数据可以看出，高良姜素在3位羟基进行适当的结构修饰可以大大增强对K562细胞的抑制活性，这为进一步构效关系的研究和发现活性更好的抗白血病药物奠定了基础。

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Structural modification of galangin and the study of inhibition activity on K562 cells

ZHAO Ling1, WU Fei-hua2

(1. School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China;2. Department of Pharmacology for Chinese Materia Medica,China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China)

To obtain some galangin derivatives with better inhibitory proliferation activity on K562 cells, and make preliminary summary of the structure-effect relationship. Use chemical methods to gain 12 derivatives from galangin, and by MTT assay measure galangin and its derivatives’ proliferation inhibition effect in five different concentrations on K562 cells. There were 10 new compounds form the 12 derivatives. A-1,A-6, A-7, A-8 and A-9, A-11 and galangin showed good activities with more than 50% inhibition rate in the concentration of 100μmol/L on K562 cells. Three derivatives A-1, A-6 and A-7 showed better activity than galangin, and A-1 had the strongest activity with the IC5016.7μmol/L. Through this study, strong active derivatives were found, and it can greatly enhance the inhibitory activities on K562 cells if appropriate structural modification is made through 3-hydroxyl on the mother nucleus of galangin. But due to the limited number of the derivatives, deep structure-effect relationship summary is still in need of further study.

galangin; structural modification; k562 cells; inhibition activity

2016-09-23.

赵玲(1982-)，女，副教授。博士研究生，E-mail：zhaolingcpu@126.com.

2095-7386(2016)04-0031-06

10.3969/j.issn.2095-7386.2016.04.006

R 914

A