HPLC法测定酱卤鸭制品卤水辣度前处理条件优化

黄 迪，陈季旺,2，王 茹，胥 伟,2，王宏勋

(1. 武汉轻工大学 食品科学与工程学院，武汉 430023； 2. 农产品加工湖北省协同创新中心，武汉 430023)

HPLC法测定酱卤鸭制品卤水辣度前处理条件优化

黄 迪1，陈季旺1,2，王 茹1，胥 伟1,2，王宏勋1

(1. 武汉轻工大学 食品科学与工程学院，武汉 430023； 2. 农产品加工湖北省协同创新中心，武汉 430023)

采用高效液相色谱(HPLC)测定卤水辣度，以超声辅助法提取卤水中的辣椒素与二氢辣椒素，探讨溶剂种类、料液比、超声频率、时间对提取得率的影响，确定较佳的提取条件，建立卤水辣度的分析方法，并测定检出限、重复性、加标回收率。结果显示：较佳的前处理条件为乙醇—水溶液(70 : 30, v/v)、料液比1: 40、时间50 min、双频超声波频率为25和40 KHz。HPLC法测定辣椒素和二氢辣椒素的检出限均为0.2 mg/mL，重复性及加标回收率良好。采用HPLC法和感官评价法分别测定5种卤水的辣度，2种方法测定的辣度一致。说明采用该前处理条件的HPLC法快速、准确、可靠，可作为卤水辣度的分析方法。

酱卤鸭制品；卤水；辣度；高效液相色谱

1 引言

酱卤鸭制品是深受消费者喜爱的风味食品，近年来形成了一系列代表性的酱卤鸭制品品牌，例如湖北的精武鸭脖、周黑鸭、小胡鸭，湖南的绝味食品，江西的煌上煌食品。酱卤鸭制品大多采用传统的卤制工艺，卤水中加入的各种香辛料赋予了酱卤鸭制品独特的风味，也是酱卤鸭制品成色的关键工艺。在长时间的高温卤制过程中，辣椒素类物质氧化分解会导致辣味损失；老卤能使酱卤鸭制品风味更佳，但在反复使用的卤汁中，存在呈味物质含量的变化[1]、香辛料中苦味成分的析出[2]等问题，且会影响酱卤鸭制品的品质及辣感[3]，仅凭经验很难通过卤水中辣椒、花椒等香辛料的使用量控制酱卤鸭制品的辣度。模糊的卤制工艺操作参数会影响酱卤鸭制品的品质调控，同一种产品的不同批次间的风味、口感相差较大，不利于对酱卤鸭制品实行标准化生产管理。

检测辣椒及辣椒制品辣度的方法较多，主要采用HPLC法，有关前处理条件的优化[4-7]、仪器的操作条件的优化[8-10]已有较多的文献报道，但是这些方法未具体说明酱卤鸭制品卤水辣度测定的前处理条件，致使分析人员采用这些方法条件测定卤水的辣度时，需要摸索样品前处理条件，给分析工作带来较大的难度。因此研究HPLC法测定卤水中辣度的前处理条件，能够节省溶剂的使用量及提取时间，并保证分析结果的准确性。

本试验参照国家标准GB/T 21266-2007[11]，采用超声辅助提取酱卤鸭制品卤水中的辣椒素与二氢辣椒素，优化前处理条件，建立卤水辣度的HPLC测定方法，定量检测卤水中的辣椒素类物质，以为控制酱卤鸭制品的辣度及生产技术的标准化提供技术支撑。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

辣卤水(5种，湖北小胡鸭食品有限责任公司提供)；辣椒素标准品(20 mg，纯度>98%，山东西亚化工有限公司)、二氢辣椒素标准品(20 mg，纯度>98%，山东西亚化工有限公司)；甲醇(色谱纯)，甲醇(分析纯，上海国药集团药剂有限公司)、无水乙醇(分析纯，上海国药集团药剂有限公司)、四氢呋喃(分析纯，上海国药集团药剂有限公司)；蔗糖(分析纯，天津市凯通化学试剂公司)；娃哈哈纯净水(500 mL瓶装，杭州娃哈哈集团有限公司)。

2.2 仪器与设备

SB-3200 DTS双频超声清洗器(宁波新芝科技有限公司)；FA114N分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；Aglilent 1260高效液相色谱仪(配有紫外检测器，美国安捷伦科技公司)；TDZ5-WS高速离心机(长沙平凡仪表有限公司)。

2.3 方法

2.3.1 卤水辣度测定的HPLC法

(1)HPLC工作条件

参考GB/T 21266-2007 辣椒及辣椒制品中辣椒素类物质测定及辣度表示方法[11]，色谱柱型号Zorbax SB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流动相为甲醇和水(65 : 35，v/v)，流速1.0 mL/min，紫外检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

(2)标准曲线的绘制

分别称取质量为0.0526 g辣椒素标准品和0.0556 g二氢辣椒素标准品，以甲醇溶解后定容至50 mL的容量瓶中，混匀后即为辣椒素和二氢辣椒素浓度均为1 mg/mL的标准品溶液。依次量取上述标液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 mL，以甲醇定容至25 mL，配制辣椒素和二氢辣椒素梯度稀释溶液的浓度为0—100 mg/L (0、20、40、60、80、100、120 mg/L)，HPLC分析(见图1)，以峰面积对浓度作图。

图1 辣椒素和二氢辣椒素标准品色谱图

辣椒素线性回归方程y=14.74x+21.12 (R2>0.99)，二氢辣椒素线性回归方y=15.02x+17.22 (R2>0.99)，在0—120 mg/L的浓度范围内，线性关系良好。

(3)卤水辣度分析前处理方法

称取均质后的卤水1 g于50 mL锥形瓶中，加入50 mL提取液超声提取。提取后，静置10 min，准确吸取5 mL于离心管中，4000 r/m离心10 min，取上清液，过0.45 μm的有机滤膜，HPLC分析(见图2)。根据卤水中辣椒素类物质总质量和检测器的灵敏度，必要时可以适当调整稀释倍数，卤水样品平行测定3次。

图2 卤水中辣椒素和二氢辣椒素的色谱图

(4)结果计算

按照(3)进行HPLC分析，卤水中辣椒素及二氢辣椒素色谱峰以各标准品的出峰时间定性，通过峰面积定量。卤水中辣椒素及二氢辣椒素得率及Scoville指数(SHU)的计算公式参考标准方法[11]。

2.3.2 超声辅助提取卤水中辣椒素及二氢辣椒素工艺优化

(1)溶剂种类对辣椒素类物质得率的影响

称取1 g卤水，置于50 mL的锥形瓶中，料液比为1 : 50，依次加入50 mL提取液，所用溶剂分别为甲醇、乙醇、甲醇—四氢呋喃，其混合比例为30、40、50、60、70、80、90、100%，超声时间为60 min，超声频率为25和40 KHz，其他超声提取条件及实验步骤同1.3.1(3)卤水辣度分析前处理方法，研究溶剂种类对得率的影响。

(2)料液比对辣椒素类物质得率的影响

在确定较佳溶剂的基础上，分别加入不同体积的溶液(10、20、30、40、50 mL)提取，使得料液比依次为1 : 10、1 : 20、1 : 30、1 : 40、1 : 50，超声时间为60 min，超声频率为25和40 KHz，其他操作步骤同(1)，测定辣椒素与二氢辣椒素得率，研究料液比对得率的影响。

(3)时间对辣椒素类物质得率的影响

在确定较佳提取溶剂、料液比的基础上，在不同的超声时间(10、20、30、40、50 min)下提取，超声频率为25和40 KHz，其他操作步骤同(1)，测定辣椒素与二氢辣椒素得率，研究提取时间对得率的影响。

(4)超声频率对辣椒素类物质得率的影响

在确定较佳溶剂、料液比、时间的基础上，在不同的超声频率(25、40、25和40 KHz)的条件下超声提取，测定辣椒素与二氢辣椒素得率，其他操作步骤同(1)，研究超声频率对得率的影响。

2.3.3 检出限测定试验

取辣椒素与二氢辣椒素混和标准溶液，用甲醇稀释后依次进行HPLC分析，使稀释后的混合标准品溶液中辣椒素和二氢辣椒素的色谱峰高度约为基线噪音的3倍，按照检出限的规定：当标准品峰高度为仪器噪音高度3倍时，该浓度时的检测值为方法的最低检出限。

2.3.4 重复性试验

取相同一批卤水样品6份，按优化后的前处理条件提取卤水中的辣椒素与二氢辣椒素，HPLC法分别测定其中的辣椒素及二氢辣椒素的得率，计算平均值、标准偏差和相对标准偏差。

2.3.5 加标回收率试验

取相同品种的卤水样品6份，分别加入1 mg/mL辣椒素标准溶液2、2.5、3 mL与1 mg/mL的二氢辣椒素标准溶液0.2、0.3、0.4 mL，然后用体积比为70%的甲醇液定容至容量瓶中，按卤水辣度HPLC测定方法依次测定，按如下公式计算：

式中：P为加标回收率—%；m1为卤水所含的辣椒素或二氢辣椒素的质量—mg；m2为加入卤水的加标准品的质量—mg；m3为称取卤水的质量—mg。

2.3.6 卤水辣度的Scoville感官评定法

根据国家标准GB/T21265-2007《辣椒辣度的感官评价方法》[12]的要求进行卤水辣度感官评价，从本实验室符合条件的研究生同学中随机挑选10位组成感官评定小组。根据HPLC法测定的结果判断卤水所在辣味区段，选择中间辣度区段及相邻的2个连续辣味区段，按下表1称取测试均质后的卤水质量。由于C—F区段的卤水称样量过小不利于操作，可固定卤水质量与提取液体积之比，相应的调整称样质量与提取液的体积。后续提取液、空白液、稀释液、品评液制备的方法及品评程序按照文献[12]中的步骤操作，确定的刚好感觉到辣的品评液，根据该品评液的体积，查阅文献[12]的附表A或B确定稀释倍数，并按照对应的辣度计算公式求得卤水辣度。

表1 不同辣味区段称取卤水的质量

辣味区段A’B’C’D’ABCDEF测试质量/g10．0005．0002．0001．0000．5000．2500．1000．0500．0500．050

注：辣味区段A’—F表示辣味由弱至强。

2.4 统计分析

试验结果以“平均值±标准差”的形式表示，每个试验重复次数至少3次。利用Excel或SPSS对所得数据进行分析，方差分析法选择ANOVA过程，显著性分析采用Duncan多重比较检验法，P>0.05表明变化不显著；P≤0.05判定为变化显著，即该因素对辣椒素类物质的提取影响较大。

3 结果与分析

3.1 超声辅助提取卤水中辣椒素及二氢辣椒素工艺优化

3.1.1 溶剂种类对辣椒素类物质得率的影响

由右图3和图4可以看出，溶剂种类对超声提取卤水辣椒素及二氢辣椒素的效果有较大的影响。乙醇溶液的浓度为30—70%时，随着乙醇浓度的增大，卤水中辣椒素类物质的得率增加。当乙醇浓度为70%时，辣椒素和二氢辣椒素的得率最高，分别为8.16 mg/g和0.74 mg/g；然而，乙醇溶液的浓度为80—100%时，随着乙醇浓度的增大，卤水中辣椒素类物质的得率降低。乙醇溶液的浓度为100%时，辣椒素和二氢辣椒素得率减小到6.31 mg/g和0.22 mg/g。造成得率变化的原因可能是不同浓度乙醇的极性差异影响了辣椒素类物质的溶解度[13]。乙醇浓度较低时，溶液的极性较大，对辣椒素类物质的溶解度小；70%的乙醇对卤水中的蛋白质、色素、糖类等杂质的溶解度较小，辣椒素类物质的溶解度达到最大，且辣椒素进入乙醇相，几乎不溶于油脂中[14]；乙醇浓度大于70%时，提取液过于黏稠，提取液中蛋白质含量较高(与70%乙醇相比)[15]，影响了辣椒素类物质的提取效果。70%的乙醇提取卤水得到的溶液呈黄色，溶液黏度小，且检测时杂质峰与辣椒素和二氢辣椒素的色谱峰能较好的分开。

图3 甲醇—四氢呋喃、甲醇、乙醇浓度对辣椒素得率的影响

图4 甲醇—四氢呋喃、甲醇、乙醇浓度对二氢辣椒素得率的影响

甲醇—四氢呋喃浓度低于70%时，辣椒素类物质的峰与其他杂质峰相邻，并且调整流动相的比例，不能将辣椒素的峰与其他杂质峰分开。这可能是因为四氢呋喃极性比较小，脂溶性较大，提取了大量油溶性的化合物，对辣椒素和二氢辣椒素的检测造成干扰。当甲醇—四氢呋喃浓度为90%时，二氢辣椒素得率远高于甲醇、乙醇的得率，其原因可能为甲醇—四氢呋喃混合提取液中，与辣椒相比，卤水的成分比较复杂，其中的水分及油脂的含量显著高于干辣椒，并且加入了多种调味料，姜、蒜中含有与二氢辣椒素具有类似的结构物质，与二氢辣椒素色谱峰存在共色谱现象[10]，卤水在反复使用的过程中游离氨基酸的含量较高[16]，对紫外检测造成较多的干扰。甲醇溶液的浓度从30%逐渐增加到100%时，辣椒素得率逐渐增加，由5.55 mg/g增大到7.99 mg/g；甲醇浓度为90%时，二氢辣椒素的得率最大，从0.30 mg/g增加到0.73 mg/g；当甲醇溶液浓度在70—90 %的范围内时，甲醇的比例继续增大，辣椒类物质得率的增加幅度变小，增加量为0.21 mg/g；甲醇溶液浓度从90%增大到100%时，辣椒素的得率无明显增加。

综合以上结果，70%乙醇溶液提取卤水中辣椒素和二氢辣椒素的得率较高，能取得较好的提取效果，后续试验采用70%乙醇为提取溶剂。

3.1.2 料液比对辣椒素类物质得率的影响

料液比对辣椒素及二氢辣椒素得率的影响见图5。由图5可以看出，卤水质量固定时，料液比得率，随着料液比的增大，辣椒素类物质的得率增加呈先上升后下降的趋势。料液比为1 : 40时，辣椒素与二氢辣椒素得率达到最大，得率分别为5.44 mg/g和0.59 mg/g；料液比为1 : 50时，得率降低到4.39 mg/g和0.46 mg/g。由于卤水黏稠，固形物含量较高，提取溶剂量较大有利于卤水与提取液接触，并充分溶解卤水中的辣椒素与二氢辣椒素[17]。但增加70%乙醇的使用量，得率未能增加，造成了试剂的浪费，并对后续的操作带来一定的难度，所以选用1 : 40为后续试验采用的料液比。

图5 料液比对辣椒素及二氢辣椒素得率的影响

3.1.3 时间对辣椒素类物质得率的影响

超声时间对辣椒素及二氢辣椒素得率的影响见右图6。由图6看出，超声提取时间为10—30 min时，随着时间的增加，辣椒素和二氢辣椒素的得率显著增大，分别从5.62 mg/g和0.83 mg/g增加到6.43 mg/g和0.96 mg/g；超声提取时间为30—50 min时，随着时间的增加，得率的增幅变缓慢，在50 min达到最大值，为6.71 mg/g和0.98 mg/g。超声提取时间为60 min时，得率分别为6.07 mg/g和0.63 mg/g，与50 min相比，得率降低。随着超声提取时间增加，在一定时间范围内，能够增大得率[18]；达到最大饱和度后，继续增加提取时间，卤水中的蛋白质、脂肪、色素等物质与乙醇溶液充分混合，因而超声提取得到的杂质较多[19]，并且长时间的超声处理会对辣椒素类物质的分子结构造成破坏[20]，影响提取效果。因此，选择50 min为后续试验的提取时间。

图6 时间对辣椒素及二氢辣椒素得率的影响

3.1.4 超声频率对辣椒素类物质得率的影响

不同超声频率下，辣椒素类物质得率的变化见下表2。由表2可以看出，不同的超声提取频率对辣椒素类物质得率的影响不明显。超声功率固定时，超声频率增大，辣椒素和二氢辣椒素的得率增加的幅度较小，增加量分别为0.23 mg/g和0.01 mg/g；使用双频超声提取时，辣椒素和二氢辣椒素的得率分别为6.62 mg/g和0.98 mg/g，达到最大。超声频率影响卤水中辣椒素类物质得率的原因可能为：高频率的超声波具有较高的能量，机械搅拌和热效应也越强[21]，能加快提取过程；较高频率的超声波具有较好的热效应，使得辣椒素类物质溶解度增大，并加速了溶液中分子的热运动[22]，使得卤水中的各种成分均匀混合，利于乙醇溶液的提取。因此采用双频超声波频率为25和40 KHz同时作用。

表2 超声频率对辣椒素及二氢辣椒素得率的影响

超声频率/kHz辣椒素得率/(mg/g)二氢辣椒素得率/(mg/g)256．200±0．099b0．970±0．007b406．503±0．073a0．977±0．005a25+406．624±0．085a0．983±0．002a

注：同一列数据中，不同字母表示差异显著 (P≤0.05)。

3.2 HPLC法测定卤水中辣椒素类物质的方法

3.2.1 检出限测定试验

HPLC法测定卤水中辣椒素类的检出限为0.2 mg/mL，二氢辣椒素的检出限为0.2 mg/mL，均低于卤水中的含量，由此可以看出HPLC法能较好的检测酱卤鸭制品卤水中的辣椒素与二氢辣椒素含量。

3.2.2 重复性试验

HPLC法测定卤水中辣椒素类物质的重复性试验结果见下表3，辣椒素的RSD为3.52%，二氢辣椒素的RSD为5.58%，可以看出HPLC法测定卤水辣度的重复性良好，相对标准偏差较小，表明该方法能满足分析检测方法的要求。

表3 HPLC法的重复性(n=6)

卤水编号辣椒素得率/(mg/g)二氢辣椒素得率/(mg/g)12．730．3222．690．3132．570．2842．760．3352．540．2962．580．30平均值/(mg/g)2．650．30标准差/(mg/g)0．090．02相对标准偏差/%3．525．58

3.2.3 加标回收率试验

表4 辣椒素的加标回收率(n=2)

辣椒素得率/(mg/g)加入标准品质量/mg加标后得率/(mg/g)平均回收率/%24．5591．622．712．55．1597．4935．5293．64

HPLC法测定卤水中辣椒素的加标回收率的试验结果见上表4，二氢辣椒素加标回收率见右表5。由表4可以看出该方法测定卤水中辣椒素的平均回收率为91.6—97.5%，由表5可以看出二氢辣椒素的平均回收率90.8—95.3%，加标回收率试验结果良好，表明该方法能充分提取卤水中的辣椒素及二氢辣椒素，提取过程中卤水基质的干扰较小。

表5 二氢辣椒素的加标回收率(n=2)

二氢辣椒素得率/(mg/g)添加标准品质量/mg加标后得率/(mg/g)平均回收率/%0．20．4890．790．30．30．5995．340．40．6894．33

3.3 不同种类卤水的辣度分析

以小胡鸭公司提供的5种辣卤水为原料，按照1.3.6中的感官评价方法，在较佳超声辅助提取条件下，采用HPLC法测定卤水中的辣椒素类物质的试验结果见下表6，并与感官评价法的辣度测定结果进行验证，试验结果表明HPLC法分析卤水辣度具有较好的准确性。将HPLC法所得的5种辣卤水的辣度测定结果，按Scoville指数从大到小排列，分别为D、E、A、C、B，辣度范围为32483—73122 SHU。

表6 5种卤水中的辣椒素及二氢辣椒素得率

卤水编号辣椒素得率/(mg/g)二氢辣椒素得率/(mg/g)HPLC法测定辣度/SHU感官评定法测定辣度/SHUA2．65±0．090．30±0．024846140000B1．78±0．030．99±0．013248324000C2．48±0．050．96±0．024400631000D4．19±0．221．55±0．237312260000E3．18±0．171．07±0．055646045000

感官评价法测定辣度的强弱顺序与HPLC法一致，辣度范围为24000—60000 SHU，辣度范围基本相同，其原因为辣椒素和二氢辣椒素提供了约90%的辣感[23]。感官评价法测定的卤水的Scoville指数较小，可能是卤水中含有的食盐、有机酸、脂肪、糖类与辣椒素类物质的辣感具有消杀作用[24]，存在各种风味物质感官的相互影响作用[25]，使感官评价得到的Scoville指数降低。

4 结论

HPLC法测定卤水中辣椒素与二氢辣椒素的较佳前处理条件为：乙醇—水溶液(70 : 30 , v/v)，料液比1 : 40，提取时间50 min，25 KHz和40 KHz双频超声波同时作用；采用该前处理条件的HPLC法测定卤水辣度的辣椒素和二氢辣椒素均为检出限为0.2 mg/mL，加标回收率高、重复性好；测定5种卤水辣度的Scoville指数为分别4.84×104、3.25×104、4.40×104、7.31×104、5.64×104SHU，与感官评价法的辣度测定结果(4.0×104、2.4×104、3.1×104、6.0×104、4.5×104SHU)一致，表明采用该前处理条件的HPLC法测定卤水辣度快速、准确、可靠，该研究结果可用于指导酱卤鸭制品的标准化生产。

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Optimization of pretreatment conditions for analysis of brine pungency of pot-stewed duck products using HPLC methods

HUANG Di1, CHEN Ji-wang1,2, WANG Ru1, XU Wei1,2, WANG Hong-xun

(1.School of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China,2. Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products, Wuhan 430023, China)

The ultrasonic-assisted method was used to extract the capsaicin and dihydrocapsaicin in brine of pot-stewed duck products. The solvent types, ratio of brine to solvent (g/mL), ultrasonic conditions (time and frequency) on the yield of capsaicin and dihydrocapsaicin were investigated to obtain the better pretreatment conditions. Then high performance liquid chromatography (HPLC) method for measuring the capsaicin and dihydrocapsaicin in brine was established and detection limit, repeatability, and recovery rate of the method were analyzed. The results showed that the optimized pretreatment conditions were 70% ethanol solution (v/v), ratio of brine to ethanol solution (1:10, g/mL), double frequency ultrasonic conditions (50 min and 25 and 40 KHz). The detection limit (0.2 mg/mL), repeatability, and recovery rate of HPLC method using the preferred conditions were favorable. The pungency of five kinds of brine was respectively determined by using HPLC and sensory evaluation methods, and consistent pungency was presented. The findings illustrated that HPLC method using the preferred pretreatment conditions for measuring brine pungency is effective, accurate and reliable, and it could be used as pungency analysis method for brine.

pot-stewed duck product; brine; pungency; high performance liquid chromatography

2016-10-08

黄迪(1991-)，女，硕士研究生，E-mail：dufts91@163.com.

陈季旺(1970-)，男，教授，博士，E-mail：jiwangchen1970@126.com.

湖北省重大科技创新计划项目(ZDG2015000350).

2095-7386(2016)04-0010-07

10.3969/j.issn.2095-7386.2016.04.002

TS 251.6

A